フィラリア N の定義 | Gruppo API umane 台州

Scientific Reports volume 13、記事番号: 7951 (2023) この記事を引用

241 アクセス

メトリクスの詳細

N 結合型グリコシル化は、真核生物タンパク質の重要な翻訳後修飾です。 N結合型グリカンは、フィラリアタンパク質の表面および分泌物に存在し、宿主寄生虫との相互作用に役割を果たします。グリコシル化されたブルジア・マレータンパク質の例はこれまでに同定されているが、このまたは他のフィラリア原虫の N 結合型グリコプロテオームの系統的な研究は行われていない。この研究では、LC-MS/MS による分析のために N-グリコシル化ペプチドを濃縮するために、改変された炭水化物結合タンパク質 Fbs1 を使用した強化された N-グリコ FASP プロトコルを適用しました。次に、寄生虫の 3 つの宿主段階 (雌成体、雄成体、ミクロフィラリア) のタンパク質上の N グリコサイトをマッピングしました。 N-グリコシル化ペプチドの Fbs1 濃縮により、N-グリコサイトの同定が強化されました。私たちのデータでは、1,273 個の N-糖部位を持つ 582 個の N-結合型糖タンパク質が特定されました。同定された N 糖タンパク質の遺伝子オントロジーと細胞局在予測により、それらのほとんどが膜タンパク質と細胞外タンパク質であることが示されました。雌成虫、雄成虫、ミクロフィラリアの結果を比較すると、個々の N-グリコサイトレベルだけでなく、タンパク質レベルでも N-グリコシル化にばらつきがあることがわかります。これらの変異は、潜在的な治療標的またはバイオマーカーとして適切に位置する宿主寄生虫界面のタンパク質の例として、クチクラ N 糖タンパク質および成虫拘束 N 糖タンパク質で強調されています。

Brugia malayi は、リンパ系フィラリア症を引き起こす 3 種類のヒトフィラリア原虫のうちの 1 つであり、リンパ性フィラリア症は衰弱性の慢性顧みられない熱帯病であり、現在世界 50 か国の 8 億 5,900 万人以上を脅かしています 1,2。個人の症状は、リンパ系や腎臓の損傷、最終的には性器や手足の腫れを伴うリンパ管の詰まりなど、軽度から重度まで多岐にわたります1、2。免疫正常者のリンパ系に存在する成虫は、平均して 6 ～ 8 年間生存できます。雌の線虫は何百万ものミクロフィラリア（未熟な幼虫）を放出し、ミクロフィラリアは血流に到達し、寄生虫の媒介昆虫である蚊に餌を与えて摂取することができます。蚊の体内では、ミクロフィラリアが脱皮し、いくつかの段階を経て感染性の第 3 幼虫段階 (L3) に成長し、その後、吸血によって他の人間に伝染する可能性があります。これらの L3 幼虫は、リンパ系に移動しながら脱皮して成熟し、そこでライフサイクルを完了します 1,2。リンパ性フィラリア症を撲滅するための WHO の取り組みの一環として、66 か国で 70 億件以上の治療法が提供されています 1,3。現在の治療法は、血液中を循環するミクロフィラリアを減少または排除することで感染を減らすのには効果的ですが、フィラリア症に関連する症状の原因となる成虫を殺すことはできません3,4。さらに、現在の治療に対する耐性が出現しているとの報告もなされています5,6。利用可能な制御手段を拡大するには、利用可能な薬物の選択肢と薬物標的を増やすための追加の研究が必要です。

免疫調節や免疫回避など、寄生虫が媒介する哺乳類宿主との相互作用により、B.マレーやその他のフィラリア寄生虫は免疫正常宿主内で長年生存することができ、活発な研究分野となっている7。線虫の表面に存在する複合糖質、分泌、排泄されるもの、または寄生虫によって宿主に放出される細胞外小胞に存在する複合糖質はすべて、これらの寄生虫が何年もクリアランスなく存在できるようにする重要な機構の一部です8、9、10、11。これらの重要な分子とその合成経路を詳細に解析することで、さらなる開発のための候補バイオマーカー、治療標的、ワクチン分子、または診断ツールを明らかにすることができます。例えば、リンパ系フィラリア症の現在の診断検査は、モノクローナル抗体によるウケレリア・バンクロフト循環フィラリア抗原の検出である12。最近の研究では、認識されたエピトープはグリカンであることが示されており、構造を完全に特徴付けるには追加の研究が必要である13。

重要なクラスの複合糖質は、N-グリコシル化タンパク質または N-結合型糖タンパク質です。 N-グリコシル化は、タンパク質内の特定のアスパラギン残基の窒素にグリカンが結合する複雑な翻訳後修飾であり、タンパク質のフォールディング、安定性、機能を含む多くの生物学的プロセスにおいて役割を果たします14。 N-グリコシル化が宿主病原体との相互作用において果たす役割の例は、ウイルスにおいて十分に確立されており、免疫回避を可能にする遮蔽、感染力の増加、毒性の変化などがあります15。特に、宿主免疫系からウイルスを保護することが示されている表面 N 糖タンパク質には、インフルエンザ血球凝集素糖タンパク質 16、HIV-1 エンベロープスパイクタンパク質 (gp120/gp41)17、および SARS-CoV2 スパイクタンパク質 18 が含まれます。同様の戦略が後生動物の寄生虫でも役割を果たしている可能性があります。さらに、N-グリカンの配列とモジュール性は、Acanthochheilonema viteae ES-6219 で最近実証されたように、寄生虫が短期または長期の不均一性を利用できるレベルの多様性をもたらし、宿主寄生虫の相互作用にとって重要であると考えられます 14。 20. これらの適応可能な翻訳後修飾された N-グリコプロテオームのタンパク質は、生物のプロテオームより進化し、他の種との保存性が低いと考えられています 21。したがって、フィラリア寄生虫の N 糖プロテオームには、寄生虫のライフスタイルに特異的で、哺乳動物宿主との相互作用に重要な表面 N 糖タンパク質が含まれていると予想されます。

For parasitic nematodes, the host parasite interface can be defined as the cuticle or outer exoskeleton covering of the worm, excretory-secretory (ES) components, and extracellular vesicles. Early studies of filarial worm cuticle proteins identified two B. malayi glycoproteins. gp29 (Bm2151) is a major surface glycoprotein found in the cuticle of adult worms with homology to the glutathione peroxidases that are part of the oxidative stress response22. gp15/400 (Bm6083 or Bm6084, Bma-npa-1) is a nematode polyprotein allergen related glycoprotein found in the cuticle of the adult worms and is thought to play a role in acquiring the required fatty acids that the worms cannot synthesize de novo22,23. Recently, gp15/400 was described as an immunodominant antigen targeted by human IgE monoclonal antibodies produced from parasite infected human sera24. Later studies broadened the number of cuticle associated proteins but little is known about their glycosylation status25. ES-62 (Bm9816) is a major secreted glycoprotein in filarial nematodes26,27 and of special interest due to immunomodulatory phosphorylcholine substitution of its N-glycans8,9,26. Larger proteomic studies of excreted and secreted proteins28,29, extracellular vesicle proteins30 and membrane or surface enriched proteins31 highlighted more proteins that are exposed to the mammalian host. However, the possibility of glycan-mediated interactions with the host were not addressed in these strictly proteomic analyses. N-linked glycosite mapping in Caenorhabditis elegans, a soil living nematode, identified 829 N-linked glycoproteins in one study and 1010 N-linked glycoproteins in a second21,32. These studies that identified over a thousand N-glycoproteins included all stages (egg, L1, L2, L3, L4, and adult worms) of the nematode life cycle (2015)." href="/articles/s41598-023-34936-9#ref-CR33" id="ref-link-section-d12369696e568">33. クレード V34 寄生線虫である Haemonchus contortus の最近のグリコサイトマッピングでは、混合成虫サンプルのみから 291 個の N-結合型糖タンパク質 35 が同定されました。

今回我々は、雌成虫、雄成虫、ミクロフィラリアから調製した全溶解物からタンパク質のB. malayi N-グリコサイトを同定しマッピングすることで、これらの発見を活用し、さらに発展させて、N-グリコプロテオームの特徴を明らかにし、タンパク質をさらに探索します。フィラリア宿主寄生虫相互作用のインターフェース。重要なことに、我々のデータには、クチクラと免疫調節性の宿主寄生虫相互作用タンパク質の既知の例が含まれていることを示しています。また、N 糖タンパク質の 2 つの異なるグループにも焦点を当てます。最初のセットは、10 個以上の N-糖部位を持つ N-糖タンパク質のグループです。このセットを使用して、調査した 3 種類のサンプル間の N-グリコサイト占有率の変動を調査しました。 2 番目のセットは、成虫の雌成虫と雄成虫に特有の N 糖タンパク質のグループです。私たちはこのセットを使用して、フィラリアおよび線虫に特有のタンパク質を調査しました。

約 200 匹の雌線虫、100 匹の雄線虫、または 200 万個のミクロフィラリア (TRS Labs Inc.、ジョージア州アテネ) を 10 ℃で溶解バッファー (100 mM トリス HCl pH 7.5、100 mM DTT、4% SDS (v/v)) に再懸濁しました。湿った虫ペレット 0.3 g あたり ml。溶解を開始するために、サンプルをドライアイス上で 10 分間凍結し、その後 37 °C で解凍することを 4 回行った後、ガラス製ダウンスホモジナイザーで均質化しました。次に、均質化したサンプルを 100 °C で 5 分間加熱し、氷上で冷却しました。細胞破片と壊れていない細胞を 15,000 × g で 10 分間ペレット化しました。各上清のタンパク質濃度は、PierceTM 660 nm Protein Assay Kit (ThermoFisher Scientific、Waltham MA) を使用して測定しました。

トリプシンペプチドは、以前に記載されているように生成されました36。簡単に説明すると、Microcon 30 K 遠心フィルター (Millipore Sigma、マサチューセッツ州バーリントン) を使用して、最大 400 μg の各タンパク質溶解物を尿素緩衝液 (100 mM トリス HCl、pH 8.2、8 M 尿素) に緩衝液交換しました。これに続いて、同じ尿素緩衝液中の５０ｍＭヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州）を用いて暗所で２０分間システイン残基をアルキル化した。過剰のヨードアセトアミドを洗い流し、次いで緩衝液を再び交換し、今回は50 mM重炭酸アンモニウムに交換した。次いで、タンパク質混合物をトリプシン（P8101S、New England Biolabs、イプスウィッチ、マサチューセッツ州）を用いて、酵素対タンパク質の比率1:100で37℃で一晩消化し、得られたペプチドを収集した。ペプチド濃度は、Pierce Colorimetric Peptide Assay 定量キットによって測定しました。 (サーモフィッシャーサイエンティフィック)。

N-糖ペプチドは前述のように濃縮されました 37。簡単に説明すると、100 μg の全ライセートペプチドミックスを、Microcon 30 K 遠心フィルター内で 200 μg の Fbs1 GYR と混合し、4 °C で 2 時間インキュベートしました。結合していないペプチドを遠心分離により除去した。すべての未結合ペプチドが確実に除去されるように洗浄した後、濃縮された N-グリコシル化ペプチドを 50% ギ酸で溶出しました。次いで、溶出液を凍結乾燥してギ酸と水を除去した。

100μgの凍結乾燥全ペプチド混合物（合計）からのペプチド、または100μgの出発全ペプチド混合物からのFbs1 GYR富化ペプチド混合物（Fbs1）を、18O水（Cambridge Isotope Laboratories, Inc. Andover, MA）で調製した100 mM重炭酸アンモニウムに再懸濁しました。）。 18O水で調製した100mM重炭酸アンモニウムに交換した1000単位のPNGase F（P0704、New England Biolabs）緩衝液を、TotalまたはFbs1ペプチド混合物を含む50μlの最終反応液に加えた。反応物を 37 °C で 1 時間インキュベートしました。偽の化学的脱アミド反応を避けるために、サンプルを以下に示すように直ちに LC-MS/MS で分析しました。

6 つのサンプルのそれぞれからのペプチドを質量分析法で分析しました。各サンプルについて、得られたペプチド容量の 6% を、Proxeon Easy-nLC 1000 (Thermo Scientific) を介して逆相分析カラム (Ion Opticks Aurora UHPLC カラム、25 cm × 75 μm ID、1.6 μm C18) にロードしました。カラムを Sonation Column Oven (Sonation Lab Solutions) に収容し、50 °C に維持しました。ペプチドは、2 ～ 35% B の 156 分間の直線グラジエント、85% B までの 3 分間のグラジエント、および 85% B での 7 分間の定組成流からなる 3 時間のウィンドウで溶出しました (移動相 A は水)。移動相 B は 0.1% ギ酸を含むアセトニトリルでした。溶出したペプチドを、Nanospray Flex イオン源 (Thermo Scientific) を使用したエレクトロスプレーにより流速 400 nL/min で Q Exactive 質量分析計 (Thermo Scientific) に導入しました。各フルスキャン (解像度 70 k、スキャン範囲 400 ～ 1600 m/z) から最も豊富な 10 個のイオンが HCD (高エネルギー衝突解離) によるフラグメンテーション用に選択され、フラグメンテーションスペクトルが 35 k の解像度で取得されました。 20、30、および 40 の段階的に正規化された衝突エネルギーが使用されました。 1 および 8 を超える充電状態は除外されました。動的除外は 30 秒に設定されました。各サンプルは 3 回の技術的反復で分析され、各 3 回のセットからのスペクトルが分析のために結合されました。

スペクトルデータは、Wormbase38 の結合された B. malayi プロテオーム (brugia_malayi.PRJNA10729.WBPS10.protein.fa) と NCBI39 の B. malayi プロテオームのボルバキア内部共生生物に対して検索されました。どちらも 2019 年 12 月にダウンロードされ、Byonic ソフトウェア (Protein Metrics) を使用して分析されました。、カリフォルニア州クパチーノ）。ケラチン、カゼイン、トリプシン、BSA などの一般的な汚染物質は分析から除去されました。タンパク質生産量は 1% FDR に設定されました。各質量分析データセットに使用されたその他のパラメーターは、切断部位 = RK、C 末端側 = 半特異的でした。切断の失敗 = 2; 質量許容差 = 10 ppm; 0.02 Da フラグメント質量許容度による QTOF/HCD フラグメンテーション。修正された変更 = カルバミドメチル @ C/ + 57.021464。可変修飾 = 脱アミド化:18O(1) / + 2.988261 @ N、酸化/ + 15.994915 @ M、脱アミド化 / + 0.984016 @ N および Q、アセチル @タンパク質 N 末端 / + 42.010565、Gln- > pyro-Glu/ -17.026549 、アミド化 @ D および E / -0.984016。質量分析プロテオミクスデータは、データセット識別子 PXD039002 および 10.6019/PXD039002 で PRIDE40 パートナーリポジトリを介して ProteomeXchange コンソーシアムに寄託されています。

Fbs1 が豊富なサンプルでは、ペプチドが Byonic スコア > 200 およびペプチド長 > 4 を必要とするように結果をフィルタリングしました。より複雑な合計サンプルについては、Byonic スコア > 300 およびペプチド長 > 4 を使用しました。 Byonic スコアは、ペプチドスペクトルの一致の精度の尺度です 41。サンプルの 1 つの複製で 1 つのタンパク質のみに関連付けられ、残りの 5 つのサンプルには存在しなかった単一の固有のペプチドは、補足表 S1 でアスタリスクでマークされ、さらなるデータ分析には含まれません。 LC-MS/MS によって同定されたタンパク質を、異なるタンパク質 ID を使用した以前に公開されたプロテオミクス研究 28、29、30、31、42、43 と比較するために、Wormbase38 データベースと UniProt44 データベースを相互参照して、データの Wormbase ID を PUB_loci に関連付けました。 /pub_locus 番号、または B. malayi プロテオームの UniProtKB ID、および NCBI ID を UniProtKB ID またはボルバキアプロテオームの wBm 遺伝子番号と関連付けるための UniProt データベースに送信します。相互参照に使用されるデータセット内の各タンパク質に関連することがわかった同義語は、補足表 S2 にリストされています。

We used NetNGlyc-1.046 to find the canonical N-X-S/T glycosites present in each N-glycoprotein. We used Weblogo47 to create a sequence logo for extracted -10 to + 10 amino acid sequences. We used BioVenn48 to generate a proportional Venn diagram. We used TMHMM-2.049 to predict transmembrane domains. We used UpsetR50 to generate UpsetR intersecting set plots. The gene ontology identification and functional enrichment analysis was performed using g:Profiler (version e105_eg52_p16_e84549f.) with g:SCS multiple testing correction method applying significance threshold of 0.0551. We used ggplot (2016)." href="/articles/s41598-023-34936-9#ref-CR52" id="ref-link-section-d12369696e755"> 52 を使用して、遺伝子濃縮データ分析から散布図を生成します。私たちは DeepLoc を使用して、各 N 糖タンパク質の細胞内局在を予測しました 53。我々は、Wormbase の Parasite Biomart を使用して C. elegans と H. contortus の両方のオルソログを検索し、B. malayi N-糖タンパク質を同定しました 54。我々は、Clustal Omega を使用して複数の配列アラインメントを生成しました 55。

改良された N-グリコ FASP メソッドでは、N-グリコシル化ペプチドに特異的に結合する Fbs1-GYR 変異体を使用します。この人工タンパク質は、広範囲の N-結合型糖ペプチドに対して選択的であり、レクチン ConA、WGA、および RCA12037 の混合物を使用する標準的な N-グリコ FASP プロトコルと比較して、濃縮度が 2.2 倍高く、偏りが少ないことが示されました。また、Fbs1 濃縮法は、O 結合型グリカンやその他の親水性分子の濃縮を可能にする選択性の低い方法 (HILIC またはヒドラジド) よりも N-グリコサイト分析に適していることも示されました 37。

濃縮されていない全プロテオームサンプル (合計) と Fbs1 濃縮後のサンプル (Fbs1) の両方から、18O 水の存在下で PNGase F で処理したサンプルを、雌成虫、雄成虫、ミクロフィラリアについて LC-MS/MS によって分析しました。 PNGase F は、アミド結合で切断することによってアスパラギンに結合したオリゴマンノース、ハイブリッドグリカン、および複合グリカンを特異的に放出するペプチド N-グリコシダーゼです 56。 18O水中でのPNGase Fによるグリカンの切断は、アスパラギンが18Oの取り込みによりアスパラギン酸に変換されるため、脱アミド化イベントを生成します。これにより、ペプチドの一次アミノ酸配列に + 2.98 ダルトンの付加が生じ、質量分析によって容易に検出されます。この + 2.98 ダルトン付加されたアスパラギンを含むペプチドを、今後 N + 3 ペプチドと呼びます。 18O 水がないと、PNGase F 切断は + 0.98 ダルトンの脱アミド化をもたらしますが、これはサンプル処理中のアスパラギンの望ましくない自発的脱アミド化の結果である可能性もあります。 α (アルファ) 1-3 フコースが N-グリカンのコア N-アセチルグルコサミン (GlcNAc) に存在する場合、PNGase F は N-グリカンを放出できませんが、PNGase A のような 2 番目の酵素は使用しませんでした。コア GlcNAc の α 1-3 フコシル化は、B. malayi 58 および他のフィラリア線虫 59 には存在しません。

Fbs1 濃縮の有用性を図 1a に示します。各サンプルの N + 3 修飾の有無に応じて一致するペプチドスペクトルの数とパーセンテージがまとめられています。完全なデータは補足表 S1 にあります。「材料と方法」セクションで詳しく説明したように、サンプルを確実に比較できるようにするために、濃縮前にすべてのサンプルのペプチド濃度を決定することで入力を正規化しました。 Fbs1 の濃縮により、N-グリコシル化ペプチドの総数とデータの品質の両方が向上します。濃縮しない場合、全サンプル中の N + 3 ペプチドの数は全ペプチドの 1% ～ 3% に制限されます。合計サンプルで数万個のペプチドが同定されたとしても、最終的に同定された N + 3 ペプチドの数は 45 ～ 241 個であり、雄の線虫サンプルには最も少なく存在します。対照的に、Fbs1 が豊富なサンプルには 213 ～ 1366 個の N + 3 ペプチドが含まれており、合計サンプルと比較した場合、利用可能な N + 3 ペプチドデータが 4 ～ 5 倍増加しています。さらに、N + 3 ペプチドを N-グリコサイトとして定義するには、標準的な N-グリコシル化部位モチーフ、NXS/T (X はプロリン 21 以外の任意のアミノ酸) が必要でした。 (NXS/T 配列は、今後、標準的な N-グリコサイトと呼ばれ、標準的な N-グリコシル化部位を持つ N + 3 ペプチドは、特定された N-グリコサイトと呼ばれます。特定の同定された N-グリコサイトは、アミノ酸配列におけるアスパラギンの位置、その後にその NXS/T 配列が続きます (例: 67 NET) したがって、同定された N-糖鎖部位であるために、すべての N + 3 ペプチドが標準的な N-糖鎖部位を含むかどうか評価され、注目されました。図 1a ではオレンジ色で示しています。これらの結果は、Fbs1 濃縮サンプル中の標準 N-糖鎖部位と N + 3 修飾が高い一致を示しているため、N-糖鎖部位の同定における Fbs1 濃縮法の威力と有用性を例示しています。 3 つの Fbs1 サンプル全体で、サンプル内のすべてのペプチドの 74 ～ 87% が標準 N-グリコサイトに存在する N + 3 修飾を持っています。図 1c は、N + 3 修飾を持つペプチドに焦点を当てており、Fbs1 サンプル中の標準 N-グリコサイトを持つ N + 3 修飾ペプチドの割合が 98 ～ 99% であることを示しています。サンプルの複雑さがより高い合計サンプルでは、一致度は大幅に低くなります。予想されるように、これらの非濃縮サンプル中の全ペプチドの 0.7% ～ 1.6% のみが、標準的な N-グリコサイトに存在する N + 3 修飾を持っています (図 1a)。ただし、N + 3 修飾のあるペプチドのみを分析した場合でも、標準的な N グリコサイトを含む N + 3 修飾ペプチドは、総サンプル中の 51 ～ 84% のみに検出されます (図 1c)。このより大きなバックグラウンドは、ストリンジェンシーを高めるために利用されている全サンプルからのペプチドのより高い Byonic スコア閾値にもかかわらずです。したがって、Fbs1 によるペプチドの濃縮は、同定された N-グリコサイトの数を増加させ、バックグラウンドを減少させます。

Fbs1 エンリッチメント。各バーは、メスの線虫 (♀)、オスの線虫 (♂)、およびミクロフィラリア (Mf) の合計 (濃縮なし) サンプルまたは Fbs1 濃縮サンプルの両方の (a) のペプチドスペクトルマッチの平均、または (b) の同定されたタンパク質の平均を表します。明るい灰色で非 N + 3 とラベル付けされているのは、N + 3 修飾のないペプチドまたはタンパク質です。濃い灰色で「N + 3: Other」とラベル付けされているのは、NXS/T グリコサイトを持たない非標準的な N + 3 含有ペプチドまたはタンパク質です。オレンジ色のラベルが付いた N + 3: NXS/T は、N + 3 修飾と関連する標準的な NXS/T グリコサイトの両方を備えた N-グリコサイトペプチドまたはタンパク質です。バーの隣の濃い灰色のパーセンテージは、サンプル全体における N + 3: Other のパーセンテージを表します。バーの隣のオレンジ色のパーセンテージは、サンプル全体中の N + 3: NXS/T ペプチドまたはタンパク質を表します。円グラフは、(c) の N + 3 ペプチド、または (d) の N + 3 ペプチド含有タンパク質の、Other 対 NXS/T のパーセンテージを表します。

タンパク質レベルで結果を見ると、Fbs1 濃縮の結果が反映されます。 6 つのサンプルのうち 1 つの複製のみで単一の固有のペプチドによって同定されたタンパク質は、分析から除外されました (補足表 S1、* 単一ペプチド)。 Fbs1 が豊富なサンプルでは、図 1b に見られるように、より高い割合のタンパク質が N + 3 修飾を持ち、その範囲は 78 ～ 88% でした。対照的に、全サンプルでは、N + 3 修飾は雄の線虫のタンパク質の 4%、雌の線虫およびミクロフィラリアのタンパク質の 13 ～ 18% にしか見つかりませんでした。合計サンプルについて、図 1d は、NXS/T 配列の場合と同様の、標準 N-グリコサイトを持たない N + 3 ペプチド含有タンパク質が比較的同数あったことを示しています。 Fbs1 濃縮では、標準的な N-グリコサイトを持たない N + 3 ペプチドを含むタンパク質は 1 ～ 6% のみでした。これにより、同等の投入量を分析した合計または非濃縮サンプルと比較して、Fbs1 濃縮サンプルでは 4 ～ 5 倍多くの N-グリコシル化タンパク質が同定されます。

分析された 6 つのサンプルでは、合計 2,000 を超える異なるタンパク質が同定されました (補足表 S2)。 N + 3 修飾があり、標準的な N 糖鎖部位を必要とするすべてのタンパク質を抽出した後、1,273 個の N 結合糖鎖部位を持つ 582 個の N-グリコシル化タンパク質を同定しました (補足表 S3)。このデータは、メスの線虫、オスの線虫、ミクロフィラリアからプールされたサンプルの技術的複製から生成されたことに注意してください。比較すると、C. elegans の N-糖プロテオームには 1,000 を超える N-糖タンパク質が含まれており 21,32、すべての生活段階を網羅しており、H. contortus の N-糖プロテオームには成虫のサンプルである 282 個の N-糖タンパク質 35 が含まれているため、この B. malayi N は成虫およびミクロフィラリアのサンプルからの - グリコプロテオームは、哺乳動物の宿主段階で存在するフィラリアの N-グリコプロテオームの優れたスナップショットを提供します。

研究された他の N 糖プロテオームと同様に、N 糖部位の分布は 482 部位 (38%) の NXS と比較して、791 部位 (62%) の NXT に有利でした 21。追加の保存モチーフを検索するために、特定された N-グリコサイトの上流と下流の 10 アミノ酸の配列を抽出しました 47 (補足表 S3、補足図 S1)。データは、予想される NXS/T を示しました。ここで、X はプロリンを除く任意のアミノ酸であり、追加のモチーフはありません。ボルバキア内部共生生物由来のタンパク質がサンプル中に見つかりましたが、予想通り、これらのいずれも N-糖タンパク質として同定されませんでした (補足表 S2)。

N-糖タンパク質の53％は1つのN-結合型糖鎖部位を持ち、残りは2つ以上のN-結合型糖鎖部位を持ちます（図2a）。 8 つのタンパク質には 10 個以上の N-結合型糖鎖部位があり、表 1 にリストされています。これらの高度にグリコシル化されたタンパク質は、Fbs1 濃縮を使用して発見できる N-糖鎖部位の数の増加を示しています。 8 つのタンパク質すべてについて、Fbs1 サンプルでは Total サンプルよりも多くの N-グリコサイトが同定されています。 Fbs1 濃縮によって明らかになった N-糖部位の数の増加は、高度にグリコシル化されたタンパク質ですぐに明らかですが、この傾向はほとんどの N-糖タンパク質で同じままです。実際、1,273 個の N-グリコサイトのうち 33 個または 2.6% だけが Total サンプルで独占的に見つかりましたが、Fbs1 サンプルでは見つかりませんでした。これらのいくつかのタンパク質は、補足表 S3 のサンプル列にアスタリスクで示されています。

N-糖タンパク質 (a) 1 ～ 10 + N-糖部位を持つ N-糖タンパク質の分布。 (b) この研究で分析した標準量のB.マレー雌虫、雄虫、ミクロフィラリアから同定された582個のN-糖タンパク質の面積比例ベン図の重複比較。

表 1 のもう 1 つの注目すべき特徴は、サンプル間の N-グリコサイト占有率のばらつきです。 6 つのサンプルすべてにわたって同定された N-グリコサイトの合計は、「すべて」というラベルの付いた 6 番目の列にリストされます。この合計を個々のサンプルで見つかった N-グリコサイトと比較すると、これらのサンプル間の N-グリコサイトのばらつきがわかります。 2 つのタンパク質、Bm2376a および Bm6131 では、同定された N-グリコサイトの合計がミクロフィラリアで見つかった合計と一致します。ただし、これらの N-グリコサイトのより小さなサブセットは、成虫の雄と成虫に見られます。他の 6 つのタンパク質については、個々の N-グリコサイトと重複する N-グリコサイトの混合物があり、すべてのサンプルの合計数になります。

図 3 は、Bm7191 の N-グリコサイト占有率の変動を示しています。このタンパク質は、タンパク質の最初の 604 アミノ酸が膜の外側を向き、605 から 627 までの単一の膜貫通領域が灰色 60 で強調表示された膜タンパク質であると予測されます。これには 22 の標準的な N-グリコサイトがあり、すべて膜の外側にあると予測される領域内に見つかります 46。合計 12 個の N-グリコサイトが同定されましたが、タンパク質配列のマッピングでは、メスの線虫、オスの線虫、およびミクロフィラリアで占有されているのは 67 NET の 1 つの部位だけであることが示されています。ミクロフィラリアでは、26 NGS と 145 NKT の 2 つの N-グリコサイトが独自に占有されており、雌の線虫では、120 NFT と 443 NDS の他の 2 つの N-グリコサイトが独自に占有されています。残りの 7 つの部位は、雌の線虫とミクロフィラリアの両方で占有されています。 345 NAS および 443 NDS の 2 つの部位は、N-グリコサイト予測の設定されたしきい値を下回っていましたが、N-グリコサイトとして識別され、場合によっては N-グリコサイト予測のしきい値を下げる必要がある可能性があることを示しています。 N-グリコサイト占有率の変動性は、その生物学的重要性を判断するためにさらに調査する必要があります。

Bm7191 の N-グリコサイト占有率: Bm7191 の完全なタンパク質配列が、灰色 49 で強調表示された予測膜貫通領域とともに示されています。 NXS/T 部位は、N-グリコサイトとして予測された場合、タンパク質配列内で青色に色付けされ、9 つのニューラルネットワークを使用して陪審員の合意によって決定され、NetNGlyc-1.046 による設定閾値よりも高いスコアが満たされなかった場合には赤色に色付けされます。メスの線虫（赤色の♀）、オスの線虫（緑色の♂）、およびミクロフィラリア（青色のMF）に見られるN-グリコサイトが配列の上に示されています。

雄、雌、およびミクロフィラリアでN-グリコシル化されていることが観察されたタンパク質の重複を図2bに示します。 3 つのサンプルすべてでタンパク質の 81 または 14% が N-グリコシル化されていることがわかりますが、タンパク質のほぼ半分 (ミクロフィラリアで 32%、女性で 12%、男性で 3%) は 3 つのサンプルのうち 1 つでのみ N-グリコシル化されています。。すべての N 糖タンパク質の 34% という最大の重複は、雌虫とミクロフィラリアのサンプル間で行われます。この重複は、雌の線虫に存在する子宮内ミクロフィラリアによって混乱する可能性が高く、個々の N 糖タンパク質において特定の N 糖部位が雌とミクロフィラリアの間で共通に見出される場合には、留意する必要があります。ここで調査した 3 種類のサンプルのうち、ミクロフィラリアには 477 個の最も多くの N-糖タンパク質があり、188 個という最もユニークな N-糖タンパク質が含まれています。これは、ミクロフィラリアがリンパ管から末梢循環に移動する際に免疫系を回避する必要があるためと考えられます。その後、蚊媒介体内でさらに発達します。雄の線虫は、N-糖タンパク質とN-糖部位が最も少ない（表1、図1a、c）。この観察されたN-グリコシル化レベルの低下の原因は明らかではありません。それにもかかわらず、成虫の雌の線虫またはミクロフィラリアからの Total サンプルまたは Fbs1 サンプルのいずれにも N-グリコシル化されていない雄の線虫 N 糖タンパク質が 17 個存在します。

582 個の N 結合型グリコシル化タンパク質を以前に公開された B. malayi プロテオームと比較すると、111 個のタンパク質 (19%) がこれまでどのプロテオミクス研究でも同定されていなかったことがわかりました (図 4、一致なし)。これは、存在量が少ないタンパク質や見つけにくいタンパク質をプロテオームからマイニングするための Fbs1 濃縮の力を示しています。 N-グリコシル化タンパク質の同定は、以前に公開されたプロテオームに文脈を追加します。以前に報告された 471 個のタンパク質にグリコシル化ステータスを追加しました。たとえば、136 個の N 糖タンパク質は排出分泌プロテオームと重複し、188 個は膜プロテオームと重複しました。この情報は、これらの N 糖タンパク質がどこで発見され、線虫のどの段階で存在するかを理解するのに役立ちます。

以前に公開された B. malayi プロテオームを使用した同定された B. malayi N-糖タンパク質の UpSetR データ分析: EV 201830 は細胞外小胞プロテオームです。 ES 200829 および ES 200928 は、排出プロテオームおよび分泌プロテオームのセットです。膜。 201931 は表面および膜プロテオームセットです。 BDR 201542 は、体壁、消化管、生殖管のプロテオームセットです。 SS 201143 はステージ固有のプロテオームセットです。一致しない場合は、これら 6 つのプロテオミクス研究では見つからない同定された N 糖タンパク質を示します。左側に表示されているセットサイズは、各セット内のタンパク質の数を示します。単一の点の上にあるバーは、そのプロテオームに固有の N-グリコシル化タンパク質の数を示します。複数の結合したドットの上にあるバーは、それらのプロテオームと共通する N-グリコシル化タンパク質の数を示します50。

遺伝子濃縮データを分析し、機能および局在情報を調査するために、N-グリコシル化タンパク質の遺伝子オントロジーデータアノテーションが取得され、g:Profiler51を使用して遺伝子濃縮分析が実行されました（補足表S4、図5a）。 N 結合型糖タンパク質の約 3 分の 1、つまり 179 個は存在しませんでしたが、403 個の N 結合型糖タンパク質には何らかの遺伝子オントロジーの注釈または KEGG 経路 45 情報が含まれていました。これには、N 糖タンパク質の 57% に相当する 329 個の細胞成分アノテーションが含まれており、濃縮分析により、膜結合タンパク質、細胞外タンパク質、または細胞表面タンパク質が過剰に存在することが示されました。 N-糖タンパク質の 148 または 25% に生物学的プロセスのアノテーションが付けられ、N-糖タンパク質の 123 または 21% に分子機能のアノテーションが付けられ、タンパク質分解、グリコシル化、および接着に関与するタンパク質が過剰に表示されます。同様に、グリコシル化とタンパク質分解に重要な KEGG 経路 45 も過剰に存在します。 N-グリコシル化タンパク質について予想されるように、これは、これらのタンパク質が宿主寄生虫相互作用タンパク質に期待される特性を持っていることを裏付けています。

遺伝子オントロジーと細胞内局在の予測と分析 (a): 散布図は、強化された GO 用語と KEGG データベースパスウェイを示しています。縦軸は各カテゴリのエンリッチされた用語を表し、横軸はエンリッチメント p 値を表します。濃い垂直破線で示されているように、p 値の上限は 16 でした。ドットの大きさは遺伝子番号を示し、色はサンプルの種類を示します。 GO:BP セットは最上位の生物学的プロセス遺伝子オントロジー用語、GO:CC セットは最上位の細胞コンポーネント遺伝子オントロジー用語、GO:MF は最上位の分子機能遺伝子オントロジー用語、KEGG セットは最上位の KEGG 経路です (b):比例棒グラフは、10 の異なる細胞内位置における N 糖タンパク質の数を示し、オレンジ色は予測された膜タンパク質を示し、灰色は可溶性タンパク質を示します。

さらに、細胞内局在を予測するためにシーケンスベースのアルゴリズムを使用する DeepLoc-1.0 を使用しました 53。この注釈により、細胞内局在予測が 582 個のタンパク質すべてに拡張されました (補足表 S5)。タンパク質の50％以上は膜タンパク質であると予測されており、主に細胞膜、小胞体、ゴルジ、およびリソソーム/液胞に分類されます（図5b）。可溶性タンパク質であると予測された残りの 278 個の N-糖タンパク質のうち、約半分は細胞外タンパク質であると予測されています。遺伝子オントロジー、細胞内局在予測、および以前のプロテオミクス研究からの情報は、潜在的な宿主寄生虫相互作用について N 糖タンパク質を評価するのに役立ちます。

前述の 2 つのキューティクルタンパク質、グルタチオンペルオキシダーゼと考えられる gp29 と線虫ポリタンパク質アレルゲン関連タンパク質である gp15/400 は、分析したすべてのサンプルに存在します。 gp29 のグリコサイトマッピング (Bm2151a) は可変の N-グリコシル化を示します。このタンパク質が豊富に含まれるメスの線虫サンプル (Total サンプルには 40 個の固有のペプチド、Fbs1 サンプルには 36 個のユニークなペプチド) では、39 NQT と 92 NGT の標準的な N グリコサイト 46 の両方が、Total サンプルと Fbs1 サンプルの両方でグリコシル化されていますが、オスの線虫では ( Total サンプルでは 8 つの固有のペプチド、Fbs1 サンプルでは 4 つの固有のペプチド）、Total サンプルと Fbs1 サンプルの両方のペプチドは、ミクロフィラリアでは部位 39 のみがグリコシル化されていることを示しています（Total サンプルでは 4 つの固有のペプチド、Fbs1 サンプルでは 2 つの固有のペプチド） Fbs1 サンプル内のペプチドは、部位 92 のみがグリコシル化されていることを示しています。雄の Total サンプルの部位 92 またはミクロフィラリアの Total サンプルの部位 39 と重複する非グリコシル化ペプチドは同定されないため、グリコシル化が存在しないことを最終的に確認することはできませんが、N-グリコシル化されていた場合、Fbs1 濃縮によりこれらのペプチドが濃縮されたと予想されます。前述したように、N-グリコサイトが女性組織のみに存在するか、子宮内ミクロフィラリアに存在するか、またはその両方に存在するかを女性サンプルで区別することはできません。したがって、この場合、女性サンプルの部位 92 は子宮内ミクロフィラリアによるものである可能性があります。女性の Total では 58 個の固有のペプチド、男性の Total では 26 個の固有のペプチド、ミクロフィラリアの Total では 17 個の固有のペプチドが同定されており、gp15/400 (Bm6084) は比較的豊富なキューティクルタンパク質です。これは脂質に結合することが報告されており、リピートドメイン内に単一の標準的な N-グリコサイトを含む線虫特異的ドメイン ABA-122,23 の 16 個の複数のタンデムリピートを持っています。私たちのデータは、この NLT グリコサイトがメスとミクロフィラリアのサンプルでは非グリコシル化とグリコシル化の両方で見られ、男性のサンプルではグリコシル化されていることを示しています。ただし、タンデム反復のため、これら 16 個の反復 N 糖部位のうちのいくつが占有されているかを判断することはできません。さらに、gp15/400 には、タンデムリピートには存在しない他の 8 つの標準的な N-糖鎖部位 46 があります。メスの線虫では、NDS 139、NGS 359、NVT 527、NHS 2867 のこれらの部位のうち 4 つがグリコシル化されていますが、ミクロフィラリアでは 139、359 および 527 の 3 つの部位がグリコシル化されており、オスの線虫では 527 と 2867 の 2 つだけがグリコシル化されています。対照的に、RNAi 延長寿命表現型 61 を持つ C. エレガンスのオルソログ、npa-1 はタンデムリピートを持っていますが、標準的な N-グリコサイトを持たない 46 ため、gp15/400 の N-グリコシル化が B. malayi において特殊な役割を果たしている可能性が開かれています。

Page et al. によって同定された他のキューティクルタンパク質も調べました。潜在的なクチクラ生合成および脱皮標的として 25 を示し、さらに 3 つのクチクラ N 糖タンパク質に焦点を当てています。まず、Bma-PHY-1 (Bm3843) は、B. malayi62 での RNAi 研究を通じて、キューティクルの発達に重要であることが示されています。これは、コラーゲン生合成において重要なプロリル-4-ヒドロキシラーゼα-サブユニットである C. elegans dpy-18 のオルソログです 63,64。 C. elegans dpy-18 も、異なるグリコサイトで N-グリコシル化されていることが示されています 21。 Bma-PHY-1 のペプチドは女性、男性、およびミクロフィラリアのサンプルで見つかりましたが、2 つの考えられる標準 N-グリコサイトのうち、グリコシル化ペプチドは 157 NAS のグリコサイトでのみ、また女性とミクロフィラリアのサンプルでのみ見つかりました。第二に、Bm-MLT-7 (Bm7474) は、RNAi 初期幼虫致死表現型を有する C. elegans mlt-7 のオルソログです。これは、ヘム結合活性と、クチクラ合成および脱皮に重要な必須ペルオキシダーゼ活性を有すると予測されており 65、タンパク質に存在する両方の標準 N-グリコサイトで N-グリコシル化されていることが示されています 21。私たちのデータでは、Bm-MLT-7 のペプチドが女性、男性、およびミクロフィラリアのサンプルで見つかり、女性サンプルでは 95 NST と 477 NIS の標準 N-グリコサイトの両方が N-グリコシル化されていましたが、ミクロフィラリアでは 95 のみが N-グリコシル化されていました。。第三に、Bm-CPZ-1 (Bm3754) は、ミクロフィラリアの放出が減少する B. malayi における RNAi 表現型を伴う脱皮、表皮の発達および胚後の体の形態形成において重要なカテプシンベースのシステインプロテアーゼであると予測されています 66。そのオルソログである C. elegans cpz-1 および O. volvulus cpz-1 は、脱皮欠陥を示す RNAi 表現型を持っています 67,68。 C. elegans cpz-1 は、1 つの部位が N-グリコシル化されていることが示されています 21。私たちのデータでは、このタンパク質は 3 つのデータセットすべてで見つかり、187 NYT の唯一の標準的な N-グリコサイトの N-グリコシル化ペプチドが雌の線虫とミクロフィラリアで見つかりました。非グリコシル化ペプチドからの確認はないが、雄の Fbs1 サンプルでこれら 3 つのクチクラタンパク質について N-グリコシル化が欠如していることは、雄の線虫で観察されたグリコシル化レベルの低下と、雄の線虫と雌の線虫の間でのタンパク質の N-グリコシル化のばらつきを裏付けるものである。、ミクロフィラリア。

これまでの研究では、ES-62、Bm-mif-1、Serpin、BmVal1 が宿主免疫系を調節する重要なタンパク質であることが特定されています 28。 ES-62 (Bm9816) は、N-グリカン上のホスホリルコリンに結合した宿主免疫調節活性を持つと予測されるロイシルアミノペプチダーゼです27、28。最近、混合成体サンプルからの A. viteae ES-62 の N-グリコシル化状態が特徴付けられ、PC 含有グリカンの不均一性と、タンパク質の 4 つの N-グリコシル化部位における部位占有の違いの両方が示されました 19。 A. viteae ES-62 と Bm9816 は BlastP39 によって 71% 同一ですが、それらの N-グリコサイトは重複しておらず、高レベルの同一性を持つタンパク質であっても N-グリコサイトが異なる可能性があることが強調されています。私たちのデータでは、Bm9816 は 3 つのデータセットすべてで見つかりましたが、女性サンプル (サンプル全体で 20 個の固有のペプチド) とミクロフィラリアサンプル (サンプル全体で 17 個の固有のペプチド) では比較的豊富でしたが、男性サンプル。 ES-62 では、タンパク質に存在する可能性のある 6 つの標準 N-グリコサイトのうち、メスおよびミクロフィラリアのサンプルの ES-62 について、30 NDT、128 NIT、146 NVS、241 NHT の 4 つの N-グリコサイトの N-グリコシル化ペプチドが見つかりました。 241 NHT の N-グリコサイトは、N-グリコサイトがメスの Total サンプルとミクロフィラリア Total サンプルの両方に存在し、どちらの Fbs1 サンプルにも存在しなかった数少ない例の 1 つです。男性サンプルではグリコシル化ペプチドは確認されませんでした。 Bm-mif-1 (Bm6870) はフィラリア分泌マクロファージ遊走阻害因子であり、寄生虫感染の主要抗原であることが判明しました 24,69。このタンパク質は全サンプル（雌、雄、ミクロフィラリアそれぞれに 19、8、22 個の固有のペプチド）では比較的豊富に存在しますが、Fbs1 が豊富なサンプルでは見つからず、少なくとも成虫とミクロフィラリアでは Bm-mif-1 が存在しないことを示しています。 2 つの標準的な N-グリコサイトがあるにもかかわらず、N-グリコシル化されています。異なる生活段階またはここで研究されていない条件下で N-グリコシル化される可能性があります。セルピン (Bm9380) は、ヒト好中球の酵素に作用すると考えられているミクロフィラリアセリンプロテアーゼ阻害剤です70。予想通り、セルピン由来のペプチドは女性または男性のデータセットには見つかりませんでしたが、ミクロフィラリアの Total サンプルと Fbs1 が豊富なサンプルの両方に存在し、標準 N-グリコサイト (21 NST および 266 NSS) の両方で N-グリコシル化が確認されました。 BmVal1 (Bm4233b) は、高い宿主抗体応答と宿主寄生虫の相互作用において重要なタンパク質であることが示されています 71。また、最近の B. malayi の空間トランスクリプトーム研究では、BmVal1 が、摂食、感覚、分泌、生殖行動に重要なメスの頭部に豊富に含まれる遺伝子転写産物の中で同定されており、したがって、成虫の創薬可能性が期待できる標的である 72。 BmVal1 糖タンパク質には 2 つの標準的な N 糖部位があり、両方の部位がグリコシル化された状態で植物細胞内で組換え生産されており、そのタンパク質構造が決定されています 71。私たちの研究では、メスとミクロフィラリアのサンプルでは 52 NGT と 138 NLT の両方の N-グリコサイトがグリコシル化されていましたが、オスのサンプルでは 138 の 2 番目の部位がグリコシル化されていることを確認するデータしかありませんでした。

Bm5654 は、H. contortus の免疫保護抽出物の重要な部分であることが示されているアミノペプチダーゼ (抗原 H11) のオルソログです 73,74。この保護は、N-グリコシル化と関連付けられています74。 Bm5654 は 3 つのデータセットすべてで見つかり、女性サンプル (合計サンプル中 43 個の固有のペプチド) と男性サンプル (合計サンプル中 12 個の固有のペプチド) に豊富に含まれていますが、ミクロフィラリアの合計サンプルでは 1 つの固有のペプチドのみが同定されました。 83 NVS、115 NLT、133 NMT、265 NET、419 NQT、440 NIS、789 NLT、タンパク質内に存在する可能性のある 15 の標準 N-グリコサイトのうち、8 つの N-グリコサイトの N-グリコシル化ペプチドが女性サンプルで見つかりました。そして970NDS。男性サンプルでは、970 の N-グリコサイトが 1 つだけ確認されました。ミクロフィラリアサンプルにはそれほど豊富ではありませんが、Fbs1 濃縮により、このタンパク質が 6 つの N-グリコサイトで N-グリコシル化されていることが示され、その中にはメスのサンプルでは見つからない 241 NIT の 1 つが含まれていました。 BlastP39 を使用して Bm5654 をその H. contortus オルソログ (41% 同一性) と整列させると、同定された 8 つの N 糖部位のうち 970 の最後の N 糖部位のみが共有されており、H. contortus 抗原 H11 では NSS であることが示されます。

成虫寄生虫タンパク質を検査し、子宮内ミクロフィラリアにより雌サンプルに出現する可能性のあるタンパク質を回避するために、雌および雄の線虫の両方で N-グリコシル化されているが、ミクロフィラリアの Total サンプルまたは Fbs1 サンプルのいずれにもペプチドが同定されていない 15 個の N-糖タンパク質に焦点を当てました。 (図 2b、表 2)。これらのサンプルは全線虫溶解物であるため、組織特異的な N-グリコシル化としての N-グリコサイトの部分占有、または同じ組織内の 2 つの異なるグリコシル化タンパク質の存在を区別することはできません。

Bm14109 は、雄成虫および雌成虫には見られるが、ミクロフィラリアには見られない、可変の N-グリコシル化パターンを持つ、比較的豊富なタンパク質 (雌の Total に 98 個の固有のペプチド、雄の Total に 47 個の固有のペプチド) の例です。このタンパク質は、遺伝子オントロジーに基づいた脂質トランスポータータンパク質です。以前のプロテオミクス研究では、成体女性の細胞外小胞 30、成虫の表面サンプル 31、および膜サンプル 31 で発見されており、宿主寄生虫との相互作用の可能性を示しています。このことは、最近の空間トランスクリプトーム研究によって強化されており、そこでは創薬の可能性のある宿主と寄生虫の境界面である頭部、および消化管に限定された「隠れた抗原」からの薬剤およびワクチン候補が存在する腸にも濃縮されている72。私たちの研究では、雌成虫の標準的な N 結合型糖鎖部位 12 個のうち 8 個が、部位 131 NNT、548 NET、634 NFT、1187 NRT、1524 NAT、1638 NLT、1692 NLS、および 1840 NES の位置で同定されました。 1840 では、女性と男性の Total サンプルでも非グリコシル化が見られました。メスとオスの線虫の間では N-グリコシル化にばらつきがあり、オスのサンプルでは NKT 1897 位の N-グリコサイトの 1 つだけがグリコシル化されていることがわかりました。 NCBI タンパク質 Blast39 によって同定される Bm14109 の唯一のオルソログは、線虫のスピルリナ 75 亜目または寄生性線虫のクレード III 内にあります 34。表 3 は、NCBI75 に記載されている Brugia malayi の分類を示しています。このタンパク質が宿主寄生虫界面および主に寄生性の線虫亜目に存在することは、この糖タンパク質が高度に特殊化された役割を担っている可能性があることを示しています。

Bm10521、Bm10329、および Bm10905 は、線虫のスピルリナ亜目に限定されたオルソログを持つ追加の糖タンパク質です。これらの糖タンパク質は、ミクロフィラリアのサンプルには見つかりませんが、雌成虫と雄成虫には存在します。さらに、トランスクリプトミクスデータは、Bm10521 転写物は成虫に限定されており、Bm10329 および Bm10905 転写物は成虫でより蔓延していることを示しています 76,77。 Bm10521 タンパク質は膜内に存在すると予測されていますが、その他の点では特徴付けられていません。私たちのデータは、雄の線虫では、479 NSS と 806 NDT の 8 つの標準的な N グリコサイトのうち 2 つでグリコシル化されているのに対し、メスの線虫では、749 NDS の 1 つの異なる N-グリコサイトでのみグリコシル化されていることが示されています。 Bm10329 は DeepLoc53 により細胞外タンパク質であると予測されます。以前のプロテオミクス研究では、膜が豊富なサンプルで同定され 31、空間トランスクリプトミクス研究では腸に豊富であることが判明しました 72。 1 つの標準部位は、雌虫と雄虫の両方で 253 NVT で N-グリコシル化されています。この部位は雌の線虫でも非グリコシル化されていることがわかります。最後に、Bm10905 はスピルリナ亜目だけでなくオンコセルシ科に限定されています。 DeepLoc53 によって細胞外に存在すると予測されており、それ以外の点では特徴付けられていません。私たちのデータは、考えられる 3 つの標準 N-グリコサイトのうち、メスの線虫では 37 NTS と 93 NET の 2 つの部位で N-グリコシル化されており、オスの線虫では 37 部位のみが N-グリコシル化されていることが示されています。特徴付けられたタンパク質との相同性が欠如しているため、Bm14109、Bm10521、Bm10329、および Bm10905 に機能を割り当てることは困難ですが、予測および観察された細胞位置データとともに未確定の状態であるため、これらの N 糖タンパク質はさらなる研究の魅力的な候補となっています。

表 2 の線虫に限定された N-糖タンパク質の例は、Bm3266 および Bm8085 です。遺伝子オントロジーによれば、Bm3266 は脂質に結合すると予測され、DeepLoc53 によれば細胞外タンパク質であると予測されます。 C. elegans のオルソログ F10D11.6 の RNAi は、胎児致死および幼虫致死表現型を示しました 78。 Bm3266 には 5 つの標準的な N-グリコサイトがありますが、メスの線虫では 817 NTT と 884 NAS の両方で N-グリコシル化されており、オスの線虫では 884 でのみ N-グリコシル化されています。 Bm8085 も細胞外タンパク質であると予測されており、トランスサイレチン様 (TTR) ファミリードメインを持っています。最近、この TTR ドメインを持つタンパク質がヒトフィラリア感染症の主要抗原であると報告されています 24。 C.エレガンスにおけるそのオルソログは、おそらく冗長性のためRNAi表現型を持たないが、細胞間の相互作用において重要であることが示されている。特に C. elegans ttr-52 では、アポトーシスを媒介する架橋分子として機能します 79。 Bm8085 は、雌および雄の線虫の両方で、その単一の標準 N-グリコサイト 29 NGT で N-グリコシル化されています。 Bm3266 と Bm8085 は宿主ゲノム内に密接なオルソログを持たないため、両方ともさらなる研究の興味深い候補となる可能性があります。

Bm3610 は雄と雌の線虫にのみ存在し、雌線虫では 8 つの標準 N 糖鎖部位のうち 5 つが 131 NIS、227 NMT、272 NGS、394 NRT および 477 NIS で同定され、雄線虫では 3 つの N-糖鎖部位が 131、227 で同定されています。これは遺伝子オントロジーによってゴルジ内にあると予測されるシングルパス膜貫通タンパク質ですが、DeepLoc53 はそれが ER タンパク質/酵素であると予測します。遺伝子オントロジーの分子機能は、それがグリコシルトランスフェラーゼファミリー 14 の一部であると予測しています。これらは、よく保存されているが多様なベータ-1,6-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ酵素のファミリーであり、直鎖状 N-アセチルラクトースアミノグリカンを分岐状 N-アセチルラクトースアミノグリカンに変換したり、重要な側鎖分岐を形成したりすることができます。 O-グリカン。これまでのプロテオーム研究では、この酵素の予測位置と一致せず、ES プロテオーム 29、体壁プロテオーム 42、表面プロテオームおよび膜プロテオーム 31 で Bm3610 が発見されました。 C. elegans のオルソログである F30A10.4、R07B7.6、および F35H8.2 は他の糖転移酵素で、後者はゴルジ膜タンパク質として注釈が付けられており、3 つの N-グリコサイトで N-グリコシル化されています 21。注目すべきことに、BlastP39によって同定されたこれらおよび他のC.エレガンスオルソログのN-グリコサイトにはBm3610 N-グリコシル化部位との重複がなく、これらの線虫オルソログ間のタンパク質同一性は40%未満です。 BlastP39 を使用してヒトオルソログを探すと、30% のタンパク質同一性を持つムチン型 O-グリカン分岐酵素である C2GnT380 のような酵素が見つかります。また、C. elegans オルソログと同様、C2GnT3 N-グリコシル化部位との重複はありません。これは、Bm3610 が同じグリコシルトランスフェラーゼファミリーに属していても、特にこの酵素がプロテオミクス研究で示されているように表面に存在する場合、Bm3610 が異なる役割を果たすか、異なる基質上で活性になる可能性を示しています。

線虫は、5 つのクレードに分類される多様で大きな生物グループです。 C. elegans と H. contortus はどちらもクレード V 線虫に属しますが、B. malayi および他のフィラリア線虫はクレード III 線虫の異なるグループに属します 34。私たちは、C. elegans と H. contortus の N-糖プロテオームを使用して、共通の N-糖タンパク質と B. malayi に特有の N-糖タンパク質を検索することで発見を拡張しました。我々はまず、これら 2 つの線虫プロテオームで同定された B. malayi N 糖タンパク質のオルソログを検索しました 54。我々は、582 個の B. マレー N 糖タンパク質のうち 425 個のオルソログを同定し、C. エレガンスまたは H. コントルタスではオルソログが確認されていない 157 個のフィラリアまたは B. マレー特異的 N 糖タンパク質を残しました（補足表 S6C. エレガンスおよび H. コントルタスのオルソログ、図.6）。当然のことながら、C. elegans と H. contortus は両方ともクレード V 線虫であり、互いに近縁であるため、361 個の B. malayi N-糖タンパク質は両方の種でオルソログを持っていました (図 6: 灰色の枠で囲んだ)。 B. malayi N-糖タンパク質オルソログは 31 個のみが C. elegans に固有であり (図 6: 2 番目と 4 番目のバー)、33 個だけが H. contortus に固有でした (図 6: 3 番目と 5 番目のバー)。次に、C. elegans または H. contortus オルソログがそれぞれの N-糖プロテオームに存在するかどうかを確認しました 21、32、35。 31 個の B. malayi N-糖タンパク質には、同様に N-糖タンパク質として同定されている C. エレガンスと H. コントルトゥスオルソログの両方が含まれていますが、119 個の B. マライ N-糖タンパク質には、同じく N-糖タンパク質である C. エレガンスオルソログと 71 B.マレーの N-糖タンパク質には、同じく N-糖タンパク質である H. contortus オルソログがあります。 B. malayi、C. elegans、および H. contortus の間で共有されるこの N 糖タンパク質のセットをさらに調査して、線虫の生活環に特有で、哺乳動物宿主とは異なる、または固有の重要なタンパク質を同定することができます。これらのオルソロガスな N 糖タンパク質の一部は、整列または保存された N 糖部位を有し、その他は、前述の ES-62 および H11 抗原で見出されたように異なるものであると予想されます。我々は、3つの線虫すべてのN-糖プロテオームに存在する、よく保存されたN-糖タンパク質、インテグリンベータの多重アラインメント55を使用して、これをさらに調査しました（補足図S2）。 Bm7611 ベータインテグリンには、54 NYT、276 NNS、407 NAS、537 NES、679 NET、700 NDT、および 728 NLT の 8 つの標準 N 糖鎖部位のうち、7 つの同定された N 糖鎖部位があり、3 つのサンプルすべてで 3 つの部位がグリコシル化されています。雄のサンプルに特有の 2 つの部位と、ミクロフィラリアのサンプルに特有の 2 つの部位。 C. elegans β インテグリンオルソログ (同一性 72%) では、54、276、407、537、679、および 700 の 5 つの整列 N-グリコサイトと 143 の異なる N-グリコサイトを含む 8 つの N-グリコサイトが同定されました。 NVT は B. malayi の標準的な N-グリコサイトではありませんが、H. contortus 配列では共有されています。 2 番目に同定された部位は、400 NAS の C. elegans に固有であり、他の 2 つのオルソログには存在しません。 H. contortus インテグリンベータオルソログ (同一性 72%) には、407 および 537 に 2 つの同定された N-糖鎖部位があります。276 または 679 と一致する標準的な N-糖鎖部位はありませんが、残りの同定された B. malayi N-糖鎖部位とは一致します。これは、これらの部位が H. contortus 線虫の生活環の他の段階で N-グリコシル化されていることを示唆している可能性があります。したがって、整列または保存された N-グリコサイトで観察された差異は、組織発現またはライフステージに基づく N-グリコサイト占有率の変動の可能性を強調します。さらに、オルソログを持たない 157 個の N-糖タンパク質は、フィラリアまたはマライ菌に特異的な N-糖タンパク質である可能性があるため、探索すべき有望なタンパク質のセットです。

C. elegans および H. contortus における B. malayi N-糖タンパク質に対するオルソログの UpSetR データ分析: HCON_N-糖タンパク質は、N-糖タンパク質として同定されたすべての H. contortus オルソログを示します。 HCON_ortholog は、N 糖タンパク質として同定されなかった残りの H. contortus オルソログを示します。 CELE_N-糖タンパク質は、N-糖タンパク質として同定されたすべての C. elegans オルソログを示します。 CELE_ortholog は、N-糖タンパク質として同定されなかった残りの C. elegans オルソログを示します。オーソログなしは、C. elegans または H. contortus のいずれにも同定されたオルソログがなかったことを示します。左側に表示されているセットサイズは、各セット内のタンパク質の数を示します。単一の点の上にあるバーは、そのタンパク質のセットに固有の N-グリコシル化タンパク質の数を示します。結合された複数のドットの上にあるバーは、それらのタンパク質のセットに共通する N-グリコシル化タンパク質の数を示します。灰色のボックスは、両方の種にオルソログを持った B. malayi N-糖タンパク質を示しています。

他の線虫の N-糖プロテオームや個々の B. マレー N-糖タンパク質と同様に、雄成虫、雌成虫、ミクロフィラリアの 582 個の N-糖タンパク質に含まれる 1273 個の B. マレー N-糖タンパク質のマッピングにより、プロテオームデータがさらに追加され、このフィラリア原虫の N-グリコシル化に関する現在の理解につながります。 N-糖ペプチドの Fbs1 濃縮による N-グリコサイトマッピングでは、標準的な N-グリコサイトモチーフのない N + 3 ペプチドからのバックグラウンドを減少させながら、同定された N-グリコサイトの数と割合の両方を増加させることにより、高度に濃縮されたデータセットが得られました。遺伝子オントロジーと細胞局在予測により、N-グリコプロテオームには膜タンパク質と細胞外タンパク質が豊富に含まれていることが示されました。私たちは、この N 糖タンパク質のセットがさまざまな方法で採掘できることを示しました。表 1 に示した高度にグリコシル化されたタンパク質および図 3 の Bm7191 について示した、個々のタンパク質の N-グリコサイト占有率の特性評価では、生物学的差異を示す可能性のある変動が示されており、その重要性を判断するにはさらに調査する必要があります。同様に、これらの 3 つの宿主段階における以前に同定されたキューティクルおよび免疫調節タンパク質の N-グリコシル化を調査することで、これらの生物学的に重要なタンパク質に存在する N-グリコサイト占有率の変動が確認されました。成虫の限定セットのようなタンパク質のグループとそれらが寄生虫の生物学にどのように関係しているかを調査することで、宿主界面での寄生虫と線虫に特異的な N 糖タンパク質の同定につながりました。宿主オルソログなしで同定されたこれらの N 糖タンパク質は、有望な治療薬またはバイオマーカーの候補です。この研究のフォローアップとして、我々は、無傷の N 糖ペプチドを研究し、グリカン構造と特定の糖部位を相関付けるために、PNGase F 切断を行わずに Fbs1 に富むペプチドの特性を評価する予定です 81。 N-グリコサイトのマッピングと占有研究を確認するだけでなく、雄虫、雌虫、ミクロフィラリアの各部位における N-グリカン構造とその不均一性を特徴付けることで、フィラリア寄生虫タンパク質の N-グリコシル化についての包括的な理解が得られます。

質量分析プロテオミクスデータは、データセット識別子 PXD039002 および 10.6019/PXD039002 で、PRIDE38 パートナーリポジトリを介して ProteomeXchange コンソーシアムに寄託されています。

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原稿の批判的なフィードバックと校正をしていただいた Clotilde S. Carlow、Thomas C. Evans Jr.、Lindsey J. Cantin、Laudine MC Petralia、Douglas M. Oswald に感謝します。寄生虫の糖鎖生物学研究を継続的に支援してくださったJames Ellard氏とSalvatore V. Russello博士に感謝します。

FM、CM、CR、MC、および JF は資金提供を受けており、研究が完了した時点で New England Biolabs に雇用されていました。 CR は現在モデルナの従業員です。これらの提携は、データと資料の共有に関する科学的レポートのすべてのポリシーの遵守を変更するものではありません。

New England Biolabs、イプスウィッチ、マサチューセッツ州、01938、米国

ファナ・B・マーシャ、コリーン・M・マックラング、ミンヨン・チェン、クリスティアン・I・ルーズ、ジェレミー・M・フォスター

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JF が実験を考案しプロジェクトを監督し、FM が Fbs1 濃縮については MC、質量分析については CM と CR の支援を受けて実験を設計および実施しました。 FM は結果を分析し、グラフィックを作成し、原稿を書きました。著者全員が最終原稿の改訂、編集、承認に貢献しました。

ファナ・B・マーシャまたはジェレミー・M・フォスターとの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Mersha、FB、McClung、CM、Chen、M. 他ヒト寄生線虫 Brugia malayi におけるグリコサイトマッピングによるフィラリア N-グリコプロテオームの定義。 Sci Rep 13、7951 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-34936-9

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受信日: 2023 年 2 月 8 日

受理日: 2023 年 5 月 10 日

公開日: 2023 年 5 月 16 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34936-9

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