プロスタグランジン | Gruppo API umane 台州

Communications Biology volume 5、記事番号: 1169 (2022) この記事を引用

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13 オルトメトリック

メトリクスの詳細

プロスタグランジン類似体は開放隅角緑内障の第一選択治療薬であり、眼圧を下げるのに効果的ですが、患者が服薬を遵守しないと効果が損なわれ、視神経の萎縮や重度の視力障害を引き起こします。ここでは、前房内でのプロスタグランジン F2α の新規生合成を通じて眼圧を永続的に低下させることを目的とした、組換えアデノ随伴ウイルスベクター媒介遺伝子治療の安全性と有効性を評価します。この研究は、正常血圧のブラウンノルウェーラットにおける眼圧の用量依存的な低下が 12 か月間維持されることを実証しました。重要なことは、オフタイプのリボスイッチ活性化によって治療を一時的に停止し、眼圧を正常に戻すことができることである。縦方向のマルチモーダルイメージング、電気生理学、および死後組織学により、この治療法は低用量および中用量で忍容性が高く、前房の健康に大きな悪影響を及ぼさないことが明らかになり、臨床的に適切な眼圧の低下をもたらす現在の治療戦略に代わる有望な選択肢を提供します。毎日の治療計画を遵守する必要性。

開放隅角緑内障（OAG）は、世界中で約 7,960 万人が罹患している複雑な眼疾患であり、その結果、進行性の網膜神経節細胞の喪失、視神経内の軸索損傷、そして最終的には失明に至ります1。開放隅角緑内障には複数の環境的および遺伝的危険因子がありますが、IOP上昇の根底にある生理病理学は、毛様体による房水の産生と線維柱帯を通る房水の排出との間の不均衡に焦点を当てています2。その結果、現在の治療戦略は、薬理学的および外科的の両方で、視力を維持するために網膜および視神経への機械的圧力を軽減することを目的として、房水産生の阻害または房水排出の増加によって眼圧の低下を達成することに焦点を当てています。 4,5。

薬物は第一選択治療として投与され、炭酸脱水酵素阻害剤、アドレナリン作動薬、RHO キナーゼ阻害剤、β遮断薬、プロスタグランジン F2α (PGF2α) 類似体という 5 つの主要なクラスに分類され、後者が最も広く利用されています 6,7,8。ラタノプロスト、ビマトプロスト、トラボプロストなどの PGF2α 類似体は、点眼薬を介してプロドラッグとして角膜表面に局所適用され、そこで角膜上皮全体に吸収され、角膜実質を通過する際に活性構造に加水分解されてから体内に放出されます。房水。房水への放出後、PGF2α 類似体は、毛様体筋を取り囲む細胞外マトリックスのリモデリングに続き、ブドウ膜強膜流出経路を通る排出の増加をもたらします 6、9、10、11、12、13。局所薬剤の使用は効果的であり、約 25% の IOP 低下につながりますが、その使用には、眼表面の刺激、かすみ目、虹彩の変色 (色素沈着過剰)、発赤 (充血)、過剰な成長などの多くの副作用が伴います。まつげの肥厚（多毛症）、まぶたの深さ（眼窩障害）、光過敏症、併発感染症の再発（例、ヘルペス性角膜炎）14、15、16、17、18。現在の OAG の薬物治療は忍容性が低く、点眼薬を正しく点眼することが難しいことや、点眼薬を忘れた場合にすぐに否定的なフィードバックが得られないこともあり、患者は毎日の治療計画を遵守するのに苦労することがよくあります。実際、患者の点眼薬の使用状況を電子的に監視した研究では、既存の薬物治療のコンプライアンスが極めて低く、患者の 44% が点眼薬の使用時間は 75% 未満であることが実証されました 19,20。

その結果、近年、徐放性薬物インプラントに焦点を当てた、より長時間作用する薬理学的治療の開発が推進されており、これは大動物とヒトの両方の臨床試験で研究されている21、22、23、24、25、26。徐放性ビマトプロストなどのインプラントは、最大 24 か月間 IOP の低下を引き起こすことが実証されています。しかし、その期間にわたって制御された眼圧を維持した参加者はわずか 28% であり、さらに 26.5% の患者は劣化後に救援点眼薬またはインプラントの再投与を必要としていました 23。大多数の患者でIOPの持続的な低下を達成することに加えて、このようなインプラントのもう1つの注目すべき利点は、徐放性ビマトプロストを投与された患者は結膜充血を示したものの、局所点眼薬を投与された患者と比較して特定の副作用の発生率が減少したことです。、黄斑浮腫および眼内炎症２７．インプラントは比較的安全であることが証明されていますが、インプラント交換の結果として角膜内皮細胞の損失を発症する患者もおり、そのため連邦医薬品局 (FDA) はこれまでのところ、再投与なしで患者の片眼あたり 10 μg のインプラントを 1 つまでに制限しています。管理が許可される27。

OAG の発症の根底にある遺伝的病因は大多数の患者で完全に理解されていないにもかかわらず、遺伝子治療は依然として魅力的な治療戦略であり、1 回の介入で疾患表現型を生涯にわたって矯正できる可能性があります 28,29,30。目の独特の特性により、眼科適応症は過去数十年にわたって遺伝子治療分野の最前線にあり、通常は組換えアデノ随伴ウイルス (rAAV) ベクターの使用に焦点が当てられてきました。さまざまな種類の眼球細胞およびさまざまな種における安全かつ持続的な導入遺伝子発現を媒介するための前臨床および臨床研究31、32、33、34、35。研究の大部分は、レーベル先天性黒内障、脈絡膜血症、色覚異常などの稀な遺伝性単因性網膜疾患の治療に焦点を当てているが、根底にある生理病理学が明らかである限り、遺伝子治療はOAGなどの複雑な病因を持つ疾患の治療にも使用される可能性がある。はよく理解されています36,37,38,39,40,41,42。数十年にわたる臨床実践により、OAG患者におけるIOP低下と良好な視覚結果との間に明確な相関関係があることが実証されているため、高眼圧症は、OAG患者の視力を維持するために遺伝子治療アプローチによって調節できる明確で修正可能な危険因子であると提案します。患者。具体的には、プロスタグランジン類似体は OAG 治療のゴールドスタンダードであり、患者のコンプライアンスの悪さによって損なわれない限り、IOP を低下させるのに非常に効果的であるため、我々は、rAAV を介した過剰な治療により眼内で直接 PGF2α の生合成を促進する遺伝子治療治療の開発を目指しました。前房の細胞内からの、PGF2αの生合成における律速酵素であるプロスタグランジンエンドペルオキシドシンターゼ2（COX2）の発現43。天然のPGF2αを合成して放出するrAAV媒介遺伝子治療の開発は、安全かつ持続的な方法でIOPを低下させるのに十分であり、患者の不服従の排除を通じて、発生率と重症度も軽減しながら視覚的転帰の改善につながる可能性があると我々は仮説を立てている。プロスタグランジン類似体を局所投与したときに観察される副作用の例。

ここでは、正常血圧ブラウンノルウェー（BN）ラットを利用して、単回治療用量後に高眼圧症に苦しむ患者のIOPを低下させることを目的としたPGF2α発現rAAV遺伝子療法治療の安全性と有効性を評価します。マルチモーダルイメージング、電気生理学、眼圧測定、死後組織学を組み合わせて使用し、投与されたベクターゲノムとIOPの間の明確な用量依存関係を実証しました。重要なことに、本発明者らは、耐容性の高い用量で12ヶ月間、臨床的に意味のある高眼圧症の減少を達成した。ユニークなことに、発現カセット内にテトラサイクリン応答性リボスイッチ要素を含めることにより、経口薬の投与により導入遺伝子の発現が一時的ではあるが効果的に「スイッチオフ」され、正常血圧への復帰につながることを実証します。この治療法は、OAG の臨床管理におけるパラダイムシフトを表し、患者のコンプライアンス問題を取り除くことで視覚的転帰を改善し、医療負担、費用、副作用の軽減を通じて患者の生活の質を向上させることができます。

前房の細胞からの PGF2α の新規産生を促進するために、我々はまず、コドンで分離されたヒトプロスタグランジン F 受容体 (PTGFR) に加えて、コドン最適化されたヒト COX2 (PGF2α 生合成における律速酵素) をコードする発現カセットをクローニングしました。 P2A 切断部位であり、遍在的に発現する小さなニワトリベータアクチン (CBA) プロモーターによって駆動されます。発現構築物内に PTGFR を含めることは、エフェクター分子 (PGF2α) とそれ自体の受容体の両方が標的組織内に高レベルで存在する「生物学的回路」を構築するために選択されました。これは、猫で以前に示されている戦略です。 COX2 単独の発現よりも IOP の大幅な低下につながります 44。

発現カセットには、組換え rAAV ベクターへのパッケージングを可能にするために AAV2 に由来する逆方向末端反復 (ITR) が隣接しており、また、以前に実証した 2 つの「オフタイプ」テトラサイクリン応答性リボスイッチエレメント (TC40 および TC45) も含まれています。活性化リガンド（すなわち、テトラサイクリン）の経口投与時に眼に注射されたrAAVベクターからの導入遺伝子発現の転写後下方制御について。 TC40 および TC45 リボスイッチは前房の細胞では発現されていませんが、テトラサイクリンは経口投与後に角膜および房水内に蓄積することが知られており、そのためリボスイッチ要素に生体利用されて遺伝子調節を駆動すると期待されています 47。発現カセットにオフスイッチを組み込むことは、プロスタグランジンベースの眼圧低下遺伝子治療の開発において重要な考慮事項であり、OAG の臨床管理では、患者が同時に発症した場合に PGF2α 治療の一時中止が必要となる可能性があります。ヘルペス性角膜炎などの感染症18、48、49。

得られたCBA.COX2.P2A.PTGFR.TC40/TC45構築物（本明細書ではCCPPと呼ぶ）（図1a）の生物学的活性は、HEK293T細胞のトランスフェクションによって最初にin vitroで検証され、その結果、有意な増加（対応のないT検定、 p = 0.0056、N = 2（偽トランスフェクト）、N = 3（CCPPトランスフェクト））、偽トランスフェクト対照と比較した培地中に分泌されるPGF2αレベル（図1b）。 CCPP 発現カセットが PGF2α の産生の大幅な増加を触媒することが確立されたため、この構築物はその後、複数の単一点変異を含む rAAV2 由来のキャプシド変異ベクターである rAAV2/2[MAX] にパッケージ化されました (Quad YF + TV: Y272F、Y444F、Y500F) 、Ｙ７３０Ｆ、およびＴ４９１Ｖ）およびペプチド挿入（７ｍ８：Ｒ５８８＿Ｑ５８９ｉｎｓＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ）は、いくつかの眼細胞タイプにおいて形質導入効率および組織浸透性を増加させることが知られている５０、５１、５２。 BNラットの前房に注射すると、このキャプシド変異血清型ベクターは、末梢角膜内皮、虹彩、虹彩角膜隅角の細胞に形質導入します（図1c、d）。

2つのテトラサイクリンオフタイプリボスイッチ（TC40およびTC45）、ならびにP2A切断シグナルによって分離されたヒトコドン最適化COX2およびPTGFRを含みながら、CMVエンハンサーおよびsmCBAプロモーターによって駆動されるCCPP導入遺伝子の図表示（a）。 PGF2α ELISA により、CCPP 導入遺伝子によるトランスフェクション後の細胞培養培地中の PGF2α 濃度が、偽トランスフェクト細胞から収集した培地よりも有意に高い濃度であることが確認されました (b) (対応のない T 検定、p = 0.0056、N = 2 (偽トランスフェクト) N = 3 (CCPP)トランスフェクトされた）、エラーバー = SD）。注射後8週間のrAAV2/2[MAX]-smCBA-mCherryの目の明視野および蛍光イメージングにより、虹彩、角膜内皮、および毛様体内のベクトル指向性が確認されます（c、d）。スケールバー = 150 μm、倍率 = 20×。

商業ブリーダーから輸入された幼若（生後 6 ～ 8 週目）BN ラット（N = 30: 雄 15 匹、雌 15 匹）は、網膜または角膜の構造または機能における発育異常またはその他の異常の存在を除外するために包括的な眼科検査を受けました。重要なことに、眼内 rAAV2/2[MAX].CCPP 注射を受ける前に、すべての動物が安定した眼圧 (IOP; 19.52 ± 3.23 mmHg、1 SD、N = 30 眼) を示しました。 BN ラットを 3 つの実験コホートのうちの 1 つにランダムに割り当て、低濃度（3.9 × 109 vg/眼）、中濃度（3.9 × 1010 vg/眼）、または高濃度（3.9 × 1010 vg/眼）のいずれかを含む等量（10 μl）の片側前房内注射を受けました。 × 1011 vg/眼) 精製 rAAV2/2[MAX].CCPP ベクターの用量。すべての動物の反対側の眼は、動物内対照として機能し、動物の体位変更中に発生する可能性のあるベクターの逆流を制限するために注射されないままであった。

注射後 1、2、6、9、12 か月後に、治療に応じた IOP の変化を可能にするために、治療群に関してマスクされた検査官によって、意識のある BN ラットに対してリバウンド眼圧測定が繰り返されました。客観的に測定されます。低用量BNラットは、ベースライン測定と比較して、時間経過中のすべての時点でIOPの非有意（NS）低下を示しました（図2a;ダネットの多重比較検定、すべての比較でp≧0.05、N = 11）、有意な傾向はありませんでした。 12 か月の評価期間全体にわたって観察されました (図 2b; 単純な線形回帰、p = 0.1549)。

IOPの用量依存的な低下が群間で見られ、低用量、中用量、および高用量の動物は12ヶ月でそれぞれ12.6%、21.87%、および43.2%の低下を示し(a、c、およびe)、それは12ヶ月にわたって維持された。 (b; 単純な線形回帰、p = 0.1549、N = 11 d; p = 0.0036、N = 9 および f; p < 0.0001、N = 10、エラーバー = SD)。 12か月目に、動物に5%w/wテトラサイクリン食を投与すると、1か月後に中用量および高用量の動物でIOPがそれぞれ21.5%および22.5%増加した(cおよびe)。

中用量ラットは、6か月でIOPの有意な低下を示し（図2c;ダネットの多重比較検定、p = 0.01、N = 9）、12か月の期間にわたって顕著なIOP低下傾向が認められました（図2d） ; 単純な線形回帰、p = 0.0036)、ベースラインから 12 か月までに IOP が 21.88% 減少しました。

高用量で治療したラットは、6、9、および12か月の時点でベースラインIOPからの有意な低下を示し（図2e;ダネットの多重比較検定、p≤0.0021、N = 10）、IOP低下の非常に有意な傾向が見られました。 12 か月の期間にわたって (図 2f、単純な線形回帰、p < 0.0001)。高用量で治療したラットは、12ヵ月目にベースラインから最も高いIOP低下を示し、全体で43.22%減少した。重要なことは、どの投与群でも、どの時点においても、研究全体を通して低眼圧（IOP ≤ 5 mmHg）の証拠を示した治療眼は存在しなかったことです。

注射後 12 か月の時点で、各用量グループの雄ラット 1 匹と雌ラット 1 匹を組織検査のために屠殺し、残りの動物には 5% w/w テトラサイクリンを含むカスタム食を与えて、TC40 の活性化を通じて遺伝子発現を「スイッチオフ」させました。 TC45 リボスイッチ要素はベクターゲノム内に組み込まれています。テトラサイクリンの栄養補助食品を 1 か月間摂取した後、導入遺伝子発現の抑制により IOP が正常な張力に戻るかどうかを判断するために眼圧測定が繰り返されました。低用量の rAAV2/2[MAX].CCPP ベクターを注射された BN ラットは、注射後の眼圧検査評価または注射前のベースラインと比較して IOP に有意な変化を示さず、テトラサイクリン投与が IOP に直接的な影響を及ぼさないことを示しました (図 2a、ダネットの多重比較検定、p = 0.4461、N = 9)。重要なことに、中用量のrAAV2/2[MAX].CCPPベクターを注射されたBNラットのIOPは、正常張力へのほぼ完全な回復を示し、IOPは12か月の測定と比較して21.5％増加しました（図2c、N = 6）。。高用量動物は、ベースラインIOPへの有意な復帰を示し(図2e;ダネット多重比較検定、p = 0.0283、N = 7)、平均IOPは12ヶ月と比較して22.5%増加した。

前房における PGF2α の新規生合成が網膜の健康に影響を与えるかどうかを評価するために、ベースラインおよび 12 か月目に共焦点走査型レーザー検眼鏡 (cSLO) および光干渉断層撮影 (OCT) イメージングを実行し、網膜の反射率と厚さの変化を検出しました。それぞれ。 cSLOイメージングにより、未治療（対照）とrAAV2 / 2 [MAX]の両方で12か月後の近赤外反射率（NIR）の増加と「縞模様の」眼底外観が明らかになりました。CCPPベクターを注射した眼は、低眼のベースラインと比較して（補足図）これは、観察された網膜形態の変化は治療や用量とは無関係に発生し、むしろ通常の老化に関連している可能性が高いことを示唆しています。

ベースライン時および rAAV2/2[MAX].CCPP 注射後 12 か月後のすべての動物の視神経乳頭の 5 回の平均 OCT B スキャンを OCT 反射率分析 (ORA) で分析し、網膜の厚さを定量化しました (補足図 2)。。視神経から 250 ミクロン刻みで 10 個の縦方向反射率プロファイル (LRP) が生成され、網膜神経線維層から RPE まで測定された網膜の厚さを決定するために使用されました (図 3)。ベースラインと比較して、未治療眼（図3a〜c）とrAAV2/2[MAX].CCPPベクターを注射した眼（図3d〜f）の両方で、12か月の時点で網膜厚の大幅な減少が観察されました。高用量群と低用量群の少なくとも 1 つの偏心は有意性を示した（二元配置 ANOVA、Sidak の多重比較検定、p = 0.0123 ～ 0.0335 (*)、0.0027 ～ 0.0087 (**)、0.0007 (***)、および < 0.0001（****）、N = 8/グループ）、一方、中用量のrAAVで治療された目（図3e）は、ある程度の薄化を示しましたが、有意には達しませんでした（二元配置ANOVA、Sidakの多重比較検定、 p > 0.1072、N = 6)。網膜の薄化は年齢の関数として複数の種で実証されており、すべての用量グループの治療および未治療の眼で観察されたため、観察された網膜厚の減少も正常な老化の結果であると仮説を立てます54,55,56,57,58。、59、60。

ベースライン測定と比較して、未治療眼（a〜c）と治療眼（d、f）の両方で、12か月の時点で視神経からのさまざまな偏心で網膜の大幅な薄化が観察されました。中用量で治療した眼では顕著な薄化は認められなかった(e)。 (ポストホック Sidak の多重比較検定を使用した二元配置分散分析、p = 0.0123-0.0335 (*)、0.0027-0.0087 (**)、0.0007 (***)、および <0.0001(****))。箱ひげ図の要素: 平均 = +、中心線 = 中央値、箱の限界 = 25 および 75 パーセンタイル、ひげ = 最小および最大)。

CCPP導入遺伝子の発現が網膜機能に悪影響を与えるかどうかを調べるために、暗順応ラットの治療眼と未治療眼の全視野網膜電図（ffERG）記録を収集しました（図4）。低線量群 (N = 11)、中線量群 (N = 8)、高線量群 (N = 10) のいずれの強度においても、治療した眼と未治療の眼の間で A 波または B 波の振幅に有意な差は見つかりませんでした (図.4a–f;複数の対応のない T 検定 p > 0.05 全グループ、補足図 3)。網膜の外観と厚さの加齢に伴う変化にもかかわらず、治療した眼と対側の未治療の眼の両方の網膜の機能的完全性は、遍在性のCCPP導入遺伝子発現の12か月の期間にわたって維持されました。

各投与量グループの平均 A 波振幅と B 波振幅の定量化を示します (a ～ f)。 A 波または B 波の処理振幅と未処理振幅の間に有意な変化は見つかりませんでした (複数の T 検定、全グループ p > 0.05。低、中、高用量でそれぞれ N = 11、8、および 10。ボックスプロット要素: 平均) = +、中心線 = 中央値、ボックス限界 = 25 パーセンタイルと 75 パーセンタイル、ひげ = 最小値と最大値)。

BN ラットに rAAV2/2[MAX].CCPP ベクターを前房内投与した後、OCT を使用して角膜中央の厚さと前房の深さを測定し、前房の健康に対する de novo PGF2α 生合成の影響を調査することにしました。 rAAV2/2[MAX].CCPPベクターを注入した眼（治療済み）と対照（未治療）眼で12か月後に実施した角膜のOCTイメージングでは、低眼眼と対照眼（未治療）のどちらの眼でも角膜中心厚に有意差は見られなかった（p = 0.7541、N = 9）。）、中用量（p = 0.7475、N = 6）または高用量（p = 0.2931、N = 6）で治療された眼（図5a〜c;すべての比較対応のないT検定）。対照的に、前房の OCT イメージングでは、低（図 5d、g; +5.2% p = 0.0125）、中（図 5e、h; +8.1%、 p = 0.0447）、および高用量（図5f、i; +24.3％、p = <0.0001）治療された眼は、対側の未治療対照眼と比較して（すべての比較対応のないT検定）。

角膜中心部の厚さは、どの投与群でも未治療の眼と治療を受けた眼の間で有意な変化はありませんでした（a〜c）。前房の深さは、未治療の対照と比較して、低用量（d、g）、中用量（e、h）、および高用量（f、i）で治療された眼において有意に増加していることが判明した。 (対応のない T 検定: p = 0.7541 (a)、p = 0.0447 (b)、p = 0.2931 (c)、p = 0.0125 (d)、p = 0.0447 (e)、および p < 0.001 (f)。N = 9、6、6、低用量、中用量、高用量の場合、それぞれエラーバー = SD)。

CCPP 導入遺伝子発現または PGF2α の新規生合成が前房で炎症反応を引き起こすかどうかを判断するために、BN ラットは治療後 12 か月目に細隙灯検査を受け、細胞、発赤、または色素分散の証拠を探し、5 段階で採点されました。試験官は、必要に応じて、ブドウ膜炎の改変されたハケット・マクドナルドおよびSUNのグレーディングスキームを使用して、動物の身元と治療の両方に関してマスクした61、62、63、64、65（補足表1）。対照と比較して、低用量のrAAV2/2[MAX].CCPPベクターを注射した眼では、前房細胞数の小さいながらも有意な増加が観察されました（図6ap = 0.0165、N = 9）が、この傾向はどちらの眼でも継続しませんでした。中用量または高用量の治療グループ（図6b、c、p = 0.7516および0.1099、それぞれN = 7および5）。同様に、rAAV2/2[MAX].CCPPベクター治療とフレアの存在との間に有意な関連を示した投与群はありませんでした（図6d〜f;それぞれp = 0.0952、p = 0.3938、p = 0.3451）。逆に、顔料の分散は、低用量（図6g、p = 0.0011）、中用量（図6h、p = 0.0020）、および高用量（図6i、p < 0.0001;すべての比較フィッシャーの直接確率検定）で大幅に増加することが観察されました。 ) rAAV2/2[MAX].CCPPベクターを注入した眼。さらに、高用量群の雄ラット 1 匹と雌ラット 1 匹は、12 か月で安楽死を必要とする下気腫を発症しました。

マスクをした参加者 5 名が採点した細隙灯検査写真を、セル (a ～ c)、フレア (d ～ f)、および虹彩色素分散 (g ～ i) について、各用量グループの未治療の眼と治療された眼の間で比較しました。フィッシャーの直接確率検定により、低用量細胞 (a) の場合、細胞の存在はベクター投与に依存するが、中用量または高用量グループ (b、c) では依存しないことが明らかになりました。フレアのすべてのケースにおいて、フィッシャーの直接確率検定により、フレアスコアはベクター投与とは無関係であることが明らかになりました（d-f）。同様に、すべての投与群で、ベクター投与に依存して虹彩剥離の増加が見られました（g-i）。 (フィッシャーの直接確率検定: p 値 = 0.0165 (a)、0.7516 (b)、0.1099 (c)、0.0952 (d)、0.3938 (e)、0.2451 (f)、0.0011 (g)、0.002 (h)、および<0.001 (i).低用量、中用量、高用量の場合、それぞれ N = 9、7、および 5)。

12か月の死後に完了した電子顕微鏡検査では、注射されていない目と注射された目で虹彩の形態が変化していることが判明し、ベクター投与量の増加に応じて虹彩が進行性の薄化を示していることが示されました（図7a〜d）。角膜内皮の形態は、低用量、中用量、および高用量で注射しなかった目と注射した目の間で変化せず、CCPP発現が内皮細胞の形態に悪影響を及ぼさないことを示しています（図7e-h）。

各投与量グループの電子顕微鏡切片と、高用量ラットの注射されていない対照眼を、虹彩（a〜d）および角膜内皮（e〜h）の質的差異について分析しました。角膜内皮細胞は変化していないことが判明したが、ベクターの投与量が増加するにつれて虹彩で進行性の薄化が認められた。倍率 = 2000×; スケールバー = 10 μm。

慢性炎症は IOP 低下と関連しているため 66,67,68、我々は、細胞、発赤、または虹彩剥離スコアと、全用量にわたる rAAV2/2[MAX].CCPP ベクター注射後の IOP 測定値との間に何らかの関係があるかどうかを判定しようとしました。。具体的には、rAAV2/2[MAX].CCPP後に観察されるIOPの低下が慢性炎症の存在によって引き起こされる場合、高い炎症スコアとIOPの低下との間に強い負の相関関係が予想される。線形回帰分析は、細胞（r2 = 0.02555）、フレア（r2 = 0.008490）、または虹彩の剥離（r2 = 0.000041;図8a〜c）の間に有意な相関がないことを示しています。炎症とベクトル線量が IOP の共変修飾因子であるかどうかを判断するために、各炎症メトリクス (細胞、発赤、虹彩剥離) の線形回帰の傾きを IOP 測定値と比較し、ベクトル線量 (低、N = 9、中、N = 9、N = 9、N = 9、N = 9、N = 9、N = 9、N = 9、N = 9、N = 9、N = 9、中、N = 9) N = 6、または高;N = 5;補足図4）。 Tukey 多重比較検定では、細胞 (p = 0.6316 ～ 0.6563)、フレア (p = 0.06436 ～ 0.6669)、または虹彩剥離 (p = 0.6166 ～ 0.6994) を含む炎症指標のいずれの用量でも回帰勾配に有意差がないことが明らかになりました。これは、眼の炎症およびrAAV2/2[MAX].CCPPベクターの投与がIOPの修飾因子ではないことを強く示している。

IOPと細胞、フレア、および虹彩の剥離と相関する線形回帰（a〜c）は、IOPの低下と前房内で観察された炎症との間に相関がないことを示しています。コラーゲンベースの線維症（青色色素）を示すマッソントリクローム染色を、未治療の眼（d〜f）と対側の治療を受けた眼（g〜i）で定性的に分析しました（倍率= 20×、スケールバー= 150μm）。治療した眼の間に明らかな違いはありませんでした。いかなる線量でも未治療の眼。

毛様体の線維化または萎縮（房水産生が減少し、治療とは独立した方法で眼圧が低下する可能性がある）が明らかであるかどうかを判断するために、マッソントリクローム、ヘマトキシリンおよびエオシン（H&E）、および過ヨウ素酸シフを利用して免疫組織化学を実施しました。 (PAS)。マッソントリクローム染色（図8d-i）では、rAAV2/2[MAX]における線維症の増加（青色色素）の証拠は示されませんでした。任意の用量グループにおける CCPP 治療眼と対側の未治療対照眼の比較（図 8d–i）。 H&E (補足図5) およびPAS (補足図6) 染色では、どの投与量グループでも、処理した眼と未処理の眼の間で毛様体の形態に明らかな違いは見られず、毛様体萎縮がないことが示されました。

まとめると、このデータは、rAAV2/2[MAX].CCPP 治療後に観察された用量依存的な IOP の低下が、ベクターまたはトランスジーン媒介炎症のいずれとも関連していないことを強く示しており、炎症指標、用量、そしてプレッシャー。さらに、房水産生の実質的な減少を示す可能性のある、毛様体に影響を与える肉眼的解剖学的病変（線維症または萎縮）の証拠はありませんでした。

開放隅角緑内障に対する既存の薬物療法（例、点眼薬）に対する患者のコンプライアンスは、忍容性の低さ、自己投与の難しさ、適切な投与を強化するための即時的な否定的なフィードバック（例、痛み）の欠如などの理由から非常に悪く、早期に診断された患者であっても、視力を脅かす合併症を発症することがよくあります。患者の不服従を減らし、視覚的転帰を改善し、毎日の治療計画を遵守することによる医療負担を軽減するために、その結果、長期間にわたり眼圧を低下させる作用をする新しい治療法の開発に多大な関心が寄せられている。薬物装置、そして最近では遺伝子治療35,69,70,71。本明細書では、マルチモーダルイメージング、眼圧測定法、電気生理学、および死後組織学を組み合わせて、虹彩角膜隅角および角膜内皮細胞からのPGF2αおよびその受容体の新規生合成を触媒する前房内注射されたrAAVベクターの有効性と安全性を実証する。、用量依存的な長期 (12 か月) の IOP 低下につながります。重要なことは、発現構築物内にテトラサイクリン応答性リボスイッチ要素を含めることにより、経口活性化薬の補給によって眼圧低下を一時的に逆転させることができることを実証したことです。これは、悪性腫瘍の出現時に治療を中止できる臨床翻訳のための重要な安全機能です。同時感染（例、ヘルペス性角膜炎）、または患者ごとに最適な導入遺伝子発現レベルに合わせて遺伝子投与を個別化する能力。

我々のデータは、最適なIOP低下を達成する上で用量が要因であること、そして重要なことに、中用量(-21.88%)または高用量(-43.22%)グループにおける眼圧の低下の程度は、現行の使用で達成されたものと同等またはそれを超えていることを示しています。薬理学的アプローチでは、ヒトにおけるラタノプロストの使用に関する以前の報告では、2 年間の継続治療後に IOP が平均 24 ～ 35% 低下することが示されています 15,72,73,74。投与されるベクターゲノムの数と観察されたIOPの低下との間の明確な用量依存関係は、提案されているOAGに対する遺伝子療法治療が個々の患者の要件に基づいて個別化される可能性があることを示すため、特に重要である。興味深いことに、用量は所望のIOP低下を達成するための重要な要素である一方、投与されたベクターゲノムの数は、CCPPに組み込まれたTC40およびTC45テトラサイクリン応答性リボスイッチ要素の活性化を通じて治療効果を逆転させる能力と直接相関することも判明した。追加の安全機能としてのベクターゲノム46。導入遺伝子発現を転写後ダウンレギュレートするためにテトラサイクリン食を1か月間与えた場合、中用量群のBNラットはベースラインに近い回復を示しましたが、高用量の動物は正常血圧への部分的な復帰のみを示し、程度が限られていることが示されました現在の発現カセットの反復を使用して、導入遺伝子の発現、およびそれによる IOP の低下を不活化することができます。高用量で治療した動物で正常血圧への完全な復帰が観察されない可能性の 1 つは、持続的な PGF2α 生合成がブドウ膜強膜流出経路の不可逆的なリモデリングを引き起こす可能性があることを含む可能性がありますが、これは光学顕微鏡でも電子顕微鏡でもすぐには明らかではありませんでした。観察された唯一の部分的復帰の別の説明は、この研究で使用されたテトラサイクリンリボスイッチのダイナミックレンジが限られているということです。この研究では、TC45 および TC40 要素が不活性状態と非活性状態の間のダイナミックレンジが比較的小さい (約 4.6 倍の減少) ことを以前に実証しました。このため、高用量で治療した眼では、テトラサイクリン食を与えた場合でも、ある程度の眼圧低下を維持するのに十分な PGF2α 生合成が残存している可能性があります 45。これが正しいことが証明されれば、より広いダイナミックレンジと、活性な「オフ」状態でのより低い発現レベルを備えたリボスイッチを開発することが、将来の研究や臨床応用にとって有益となるだろう。理想的には、テトラサイクリンの長期使用に関連する既知の臨床副作用（例、腸内細菌叢異常や歯の石灰化）と、抗生物質耐性に関連する懸念の高まりを考慮すると、そのような新規リボスイッチは、そうでない活性化リガンドに応答するように設計されるべきである。抗生物質であり、血液脳関門を非効率的に通過することが示されているテトラサイクリンよりも生体利用効率が高い75,76。それぞれグアニジン HCL とテオフィリンに応答する GuaM8HDV と TAP1 など、よりダイナミックレンジの大きなリボスイッチを含む、いくつかの代替リボスイッチが存在しますが、これらのリガンドが血液水性関門を介して容易に吸収されるかどうかは不明です 45、46、77、78。 79、80。

私たちの研究は、CCPP 導入遺伝子の過剰発現の影響が網膜の形態や機能に悪影響を与えないようであることを実証しました。 cSLO および OCT 分析により、ベースラインと比較して 12 か月後の視神経からのさまざまな離心率で NIR の増加と顕著な網膜の薄化が明らかになりましたが、これらの変化は治療した眼と未治療の眼の両方で発生し、用量とは無関係でした。対側対照）は、中用量または高用量で治療した動物よりも大きな網膜の薄化を示した。私たちのCCPP療法と反射率の増加または網膜の薄化との間に明確な用量依存関係がないため、観察された変化は正常な老化に関連していると考えており、網膜、特に網膜神経線維層の薄化は以前に示されています。ヒト、マウス、ラットのモデルでは加齢と相関します54、55、56、57、58、59、60。重要なことは、ffERG によって評価された網膜機能は、どの照明パラメーターの下でも、どの線量グループでも影響を受けなかったということです。総合すると、このデータは、rAAV2/2[MAX].CCPPの前房内投与とPGF2αのde novo生合成が忍容性が高く、網膜の健康や機能に悪影響を及ぼさず、各用量コホートの未治療眼と治療眼が同様の程度を示していることを示唆しています。反射率の増加と網膜の薄化が見られ、ffERG で観察された機能障害はありません。

提案された IOP 低下遺伝子治療の有効性を評価する際に我々が主に考慮した点の 1 つは、前房内ベクター投与および CCPP 導入遺伝子の長期発現後の前房の健康状態を評価することでした。 12ヵ月後の未治療の眼と治療後の眼の間で角膜の厚さは変化していないことが判明し、これは私たちの遺伝子治療が角膜の健康に悪影響を及ぼさないこと、そして研究全体を通して行われたIOP測定が角膜厚の変化によって混乱しなかったことを示しています。任意の用量グループ。さらに、EM により、角膜内皮、デスメ膜、および角膜実質は浮腫、薄化、または層間剥離の証拠がなく正常な形態を有しており、角膜および内皮の完全性が損なわれていないことが示されました。興味深いことに、我々は前房深さの有意かつ用量依存的な増加を観察したが、これはプロスタグランジン類似体による治療が前房深さの減少につながることを示す以前の研究とは対照的な所見である81,82。しかし、これらの研究は、緑内障患者におけるラタノプロストとピロカルピンの使用の短期的な影響のみを調べており、IOP82の上昇の直接の結果として、前房深さが年齢と性別が一致した対照よりも深いことが予想される可能性があります。結果として、この研究で観察された前房の深化は、研究全体を通して正常血圧の動物を使用したことによるアーチファクトである可能性があり、この動物は正常なベースラインの角膜曲率を有することが予想されるため、IOPが低い場合に前房の深さの顕著な変化を示す可能性があります。遺伝子治療によって人為的に低下します。あるいは、前房内での PGF2α の新規生合成自体が、プロスタグランジン類似体を角膜表面に局所的に塗布した場合に観察されるよりも広範なブドウ膜強膜リモデリングを引き起こす可能性もあります。これは、各滴の 5 ～ 10% しか吸収されないためです。角膜と残りは周囲の組織によって誤吸収されます83、84、85、86。 PGF2αの持続的な眼内生合成がどのようなメカニズムで前房深さに影響を与えているかは依然として不明であるが、OCTでは、高用量の眼の角膜中央がより湾曲していることが示され、これは角膜が実際よりも「膨らんでいる」ことを示しているようである。レンズと虹彩が後方に移動しました。高線量の眼における望ましい以上のIOP低下に加えて、前眼房の深化も患者の視力に悪影響を与える可能性があるため懸念されている。以前の研究では、白内障患者にIOLを挿入した後、前眼房が深くなることが示されている。眼房深さが 1 mm 増加すると、屈折異常の近視シフトが最大 0.32 ジオプター増加する可能性があります 87,88。

マスクをした観察者によって行われた細胞およびフレアのスコアリングでは、炎症の用量依存的な有意な増加は見られず、前房へのrAAVの注入およびCCPP導入遺伝子カセットの長期発現が十分に許容されることが示された。逆に、前房炎症は無視できることが判明したが、虹彩の分散はすべての用量グループで観察され、高用量動物では、電子顕微鏡で評価した虹彩の薄化と強く相関する非常に有意なレベルのメラノサイト遊走が示された。本研究からは、用量依存的な虹彩の剥離がメラノサイト内での CCPP 導入遺伝子の直接発現に起因するのか、rAAV2/2[MAX] 血清型が虹彩の細胞に形質導入できるのか、それともそうでないのかを判断することはできません。これは、より高いベクター用量での前房内の PGF2α 濃度の増加に関連しています。いずれにせよ、用量依存的な色素分散の観察は、虹彩がすでに不安定であり、虹彩がすでに不安定である可能性がある先天性緑内障（例、アクセンフェルト・リーガー緑内障）または色素分散緑内障の患者の眼圧を低下させるための、記載されたrAAV.CCPP遺伝子治療の使用を禁忌とする可能性が高い。その分解は、AAVによる虹彩への形質導入、またはCCPP導入遺伝子の発現およびPGF2αの生合成のいずれかを介して加速される可能性がある。しかし、（閉塞隅角緑内障や先天性緑内障とは対照的に）OAGにおける高眼圧症の病態生理学に虹彩が関与していないことを考慮すると、虹彩に形質導入しない天然に存在するまたは遺伝子操作されたrAAV血清型の選択を調査することはおそらく有益であろう。 OAG または色素分散緑内障を治療する際に、CCPP の直接発現が虹彩剥離を引き起こす可能性を排除します。

前房の細胞から PGF2α を新たに合成する経路生物学を調節することによって機能する遺伝子治療の有効性を評価する際のもう 1 つの大きな懸念は、観察された IOP の低下がブドウ膜強膜リモデリングに対する PGF2α の薬理学的作用に起因しないものであるかどうかです。ただし、前房へのrAAVビリオンの注入またはその後の治療用導入遺伝子の発現に応答した慢性炎症によるものである。この懸念は、緑内障の新規治療法を評価する場合に特に関連します。緑内障では、持続的な軽度の炎症がヒト患者の眼圧を低下させることが知られているため、ブラウンノルウェーラットなどの実験動物モデルでは交絡変数となる可能性もあります66,67。 ,68。一連の線形回帰分析と共分散分析を実行することにより、ベクターの線量 (低、中、または高) と炎症の重症度 (細胞、発赤、および虹彩剥離で等級分け) が IOP 低下の重要なメディエーターではないことを実証することができました。これは、治療群全体で観察された用量依存的なIOPの低下が主に送達されたCCPP導入遺伝子の生物学的作用によって媒介されたことを強く示している。実際、統計的有意性に近づいた唯一の回帰分析は、高用量治療群における虹彩剥離とIOPの関係であり（補足図4I）、炎症スコアが高いほどIOPが高いと相関し、正の傾きに向かう傾向があった。この研究で観察された IOP 低下の原因が慢性炎症である場合に予想される傾向とはまったく逆の傾向でした。

この研究の限界の 1 つは、すべての用量コホートにおいて、未治療の対照眼が注射眼の反対側にあったことです。具体的には、レーベル先天性黒内障の前臨床試験で見られたように、片方の目にrAAVを注射すると対側の目に影響を与える可能性があることが研究で示されており、注射した前房、注射していない前房、網膜、視神経の両方でウイルスDNAが検出された。硝子体内ベクター注射後の非ヒト霊長類89。このことから、我々の研究で観察された網膜の反射率と厚さの変化は、通常の老化の結果ではなく、注射された眼と注射されていない対側の眼の間のクロストークから生じている可能性が高まっています。しかしながら、以下の理由により、これはありそうもないことであると我々は考えている：（1）低用量群では、CCPP発現とPGF2α産生は、治療を受けた眼自体のIOPを変化させるのに十分ではなかったので、そのような低レベルの活性が存在するのは非論理的であるように思われる。注射されていない対側の目の網膜の健康に悪影響を与える可能性があります。 (2) 網膜反射率の増加と網膜薄化は、治療した眼でも未治療の眼でも用量依存性であることは観察されなかった。これは、いずれかがベクターゲノムの存在または反対側の眼におけるPGF2αの発現に起因するものであれば予想され、そこでクロストークが再び発生する。高用量で治療したBNラットで最大になると予想される。 (3) 以前の研究では、BN ラットの前房深さの平均は 778 ± 42.7 ミクロンであることが示されており、これはすべての用量にわたる未治療の眼での 12 か月の所見と同様です。90 (4) 電子顕微鏡研究のために提示された対照眼高用量で治療したラットから得られた結果は、注射された目と注射されていない目の間でクロストークが発生した場合に予想される有害な形態学的変化（例、虹彩の剥離/薄化）を示さなかった。

結論として、正常血圧のブラウンノルウェーラットを rAAV2/2[MAX].CCPP で治療すると、用量依存的に IOP が低下し、中用量の眼では有害な副作用を発現することなく、臨床的に適切な高眼圧の低下が示されました。重要なことに、IOPの低下は経口リガンドの投与によって逆転する可能性があり、これは副作用が発生した場合や共生感染症を解決する必要がある場合に治療を一時的に中止できる、臨床翻訳にとって重要な安全機能です。高用量で治療したBNラットでは虹彩の剥離と前房の深化が観察されたが、これらの動物は臨床的に関連する以上のIOP低下も示したため、rAAV2/2[MAX].CCPPベクターの過剰投与を表していると思われる。緑内障動物モデルにおけるこの治療法の効果を判定するための将来の研究、ならびに高ベクター用量で観察される副作用を制限するための最適なベクターキャプシド指向性と調整可能なリボスイッチの組み合わせを発見することにより、記載されている長時間作用型単剤の翻訳可能性が高まるであろう。開放隅角緑内障には遺伝子治療を使用します。

すべての動物実験はウィスコンシン医科大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されており、眼科および視覚研究における動物の使用に関する視覚および眼科研究協会の声明に準拠しています。生後 6 ～ 8 週の BN ラット (N = 30: 雄 15 匹、雌 15 匹) を Charles River Laboratories (BN/Crl、米国マサチューセッツ州ウィルミントン) から入手し、12:12 時間の明/暗光周期で飼育しました。食事と水を自由に与えた。さらに、向性実験のために 3 匹の BN ラットを入手しました。全身麻酔を必要とする評価では、動物を導入チャンバー（VetEquip、リバモア、カリフォルニア州）に配置し、酸素（100％、0.2～1 L/分）で提供されるイソフルランの吸入（導入5％、維持1～2.5％）によって鎮静させました。）。瞳孔の拡張は、2.5% フェニレフリン HCL および 1% トロピカミド (Akorn、レイクフォレスト、イリノイ州、米国) を含む局所散瞳点眼薬を投与することによって達成されました。

HEK293T 細胞 (ATCC 番号 CRL-11268、米国バージニア州マナサス) を、10% ウシ胎児血清 (FBS) と 1% 抗生物質を添加した高グルコース DMEM + Glutamax (Gibco Life Technologies、米国カリフォルニア州カールズバッド) で培養しました。抗真菌剤。細胞を 3.0 × 105 細胞/ウェルの密度で 6 ウェルプレートに播種し、ポリエチレンイミン (PEI) (Polysciences、#23966-100、PA、USA) を使用して 2 µg smCBA-TC40- を約 70% コンフルエントでトランスフェクトしました。減量血清 (2%) DMEM + Glutamax 培地中の COX2-P2A-PTGFR-TC45 プラスミド。 72時間後、培地をウェルから回収し、市販のELISAキットを使用して二重に分析し、PGF2αのレベルを定量した(Abcam、ab133056、ケンブリッジ、英国)。

簡単に説明すると、HEK293T 細胞は、(1) キャプシド変異体 rAAV2/2[MAX] ベクターの Rep および Cap 遺伝子を発現するプラスミドで三重トランスフェクションを受けました。（２）パッケージングに必要なアデノウイルス由来の遺伝子を発現するヘルパープラスミド。 (3)PEI52を利用した等モル比(1:1:1)の導入遺伝子発現プラスミド(smCBA-TC40-COX2-P2A-PTGFR-TC45;配列情報については特許番号US20200063137A1を参照)。細胞を、２％ＦＢＳおよび１％抗生物質抗真菌剤を含むＤＭＥＭ＋Ｇｌｕｔａｍａｘ中でトランスフェクション後７２時間、ハイパーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）内で培養した。 72時間後、以前に記載されているように、イオジキサノール密度勾配遠心分離および緩衝液交換による濃縮を通じてベクターを精製した91,92。次に、rAAV2/2[MAX]-smCBA-TC40-COX2-PTGFR-TC45の合計5つのベクター調製物を合わせ、100 kDaフィルターカラムでの緩衝液交換により濃縮して、ウイルス力価を増加させた(Amicon、ダルムシュタット、ドイツ)。 rAAV の力価は、PicoGreen アッセイ (Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム) によって決定され、240 μl の 3.9 × 1013 vg/mL (ベクターゲノム/mL) が得られました93。ベクターを HBSS + 0.014% Tween-20 で希釈して、注射用の 3 対数の用量漸増を提供しました: 3.9 × 109 vg/眼 (低)、3.9 × 1010 vg/眼 (中)、および 3.9 × 1011 vg/眼 (高い）。 in vivo 指向性実験では、rAAV2/2[MAX]-smCBA-mCherry の単一ベクター調製物を上記のプロセスと同様に調製し、1.17 × 1013 vg/mL の 80 μl が得られました。

30 匹の BN ラットに麻酔をかけ、低濃度 (3.9 × 109 vg)、中濃度 (3.9 × 1010 vg) の rAAV2/2[MAX]-smCBA-TC40-COX2-P2A-PTGFR-TC45 の片側前房内注射を受ける前に瞳孔を拡張しました。 vg)、または高用量 (3.9 × 1011 vg) を、逆流を視覚化するために少量のフルオレセインを含む 10 μl HBSS + 0.014% Tween 20 に懸濁しました。簡単に説明すると、眼科手術用顕微鏡 (Leica、Wetzlar、ドイツ) の下で、6 mm の円形ガラス製カバースリップ (Fisher Scientific、ピッツバーグ、ペンシルベニア州、米国) を角膜表面上に配置し、潤滑ゲル (2.5% ヒプロメロース、Akorn、レイクフォレスト、イリノイ州、米国）を使用した後、0.12 mm ノッチ付きストレート鉗子（#0109025、ハーグ・ストライト・ジョン・ワイス、英国）の先端を眼球の後方に進めて、外眼筋を確保し、眼球の回転を防止しました。次いで、１００μｌのハミルトンシリンジに取り付けられた１０ｍｍの３３－Ｇ斜角針を、針の先端が前眼房の中心に来るまで、角膜を通って輪部の約１ｍｍ前方に進めた。 10μlの精製ベクターの注射後、過剰な逆流を制限するために、IOPが安定するまで（角膜実質の除去と正常な網膜灌流の再開によって視覚的に示される）、針の先端を所定の位置に保持した。同様に、3 匹の BN ラットに、生体内指向性実験のために rAAV2/2[MAX]-smCBA-mCherry を両側前房内注射し、それぞれ 1.13 × 1011 vg を投与しました。

眼圧は、ラットで使用するために校正されたハンドヘルド TonoLab リバウンド眼圧計 (iCare、Oy、フィンランド) を使用して、ベースラインおよび注射後 1、2、6、9、12、および 13 か月後に測定しました。すべての測定は、IOP の概日関連変動を制限するために、定義された時間内 (11:00 ～ 13:00) に無麻酔の動物で行われました。 IOP測定に関与したすべての研究者は、ベクトル線量に関してマスクされていました。簡単に説明すると、レトルトスタンドを使用して眼圧計を水平位置に固定し、試験眼が約 1 mm 離れて眼圧計プローブに対して垂直になるように、穏やかな物理的拘束を使用してラットを配置しました。各 IOP 測定値は、3 つの独立した記録の平均です。評価の完了後、ラットにご褒美として Bacon Yummies のおやつ (Bio-Serv、米国ニュージャージー州フレミントン) を与え、麻酔なしで扱えるように条件付けしました。

動物は、カスタムマルチライン cSLO (改良型 Spectralis HRA; Heidelberg Engineering、ハイデルベルク、ドイツ) を使用して予備評価および 12 か月眼底評価を受けました。瞳孔の拡張後、近赤外 (820 nm) 反射イメージングモードを使用することでカメラの位置合わせが容易になり、眼底画像が均一に照明され、視神経乳頭が適切に中心に配置されることが保証されました。キャプチャされた画像は単一フレームです。

12 か月の時点で、すべての動物に細隙灯生体顕微鏡検査 (Topcon SL-D8Z、Topcon Medical Systems、オークランド、カリフォルニア州、米国) を受けさせ、デジタルカメラ (D810、Nikon、日本) を使用して撮影した治療眼と未治療の眼の画像を撮影しました。細胞とフレアを評価するために、眼球の直径を包含する 1 mm スリットビームを使用して細隙灯画像を生成し、20 mm ビームで取得した広視野画像で虹彩剥離を評価しました。グレーディングでは、細隙灯画像を匿名化し、ランダムな順序で 5 人の独立したグレーダーに提示し、ベクター線量と動物の身元の両方に関してグレーダーが確実にマスクされるようにしました。グレーディングは、前房細胞およびフレアについては SUN グレーディングスキーム、および虹彩剥離については修正された Hackett-McDonald グレーディングスキームに従って実行されました (補足表 1)。

BN ラットは、ベースラインおよび注射後 12 か月目に網膜電図検査を受けました。ラットを一晩暗所に適応させ、すべての実験操作は薄暗い赤色照明下で実施した。記録には、電気ノイズを低減するためにファラデーケージ内に配置された0、1000、および60 Hz用のベッセルフィルターが取り付けられたカラードーム（Diagnosys LLC、ケンブリッジ、英国）に取り付けられたEspion E2システムを利用しました。イソフルランで麻酔した後、ラットを加熱ステージに置いて体温を維持し、リフレッシュ潤滑点眼薬を角膜に塗布して水分補給を維持し、導電性を確保しました。ソリッドコア皮下電極を頭皮と臀部にそれぞれ基準電極と接地電極として挿入し、金線ループ電極を両目の角膜に配置しました。反応は、6-log 輝度シリーズ (-4 ～ 0.48 log cd.s/m2) にわたる短時間 (4 ms) の単一 (1 Hz) 白色フラッシュ刺激後に記録されました。 A 波および B 波の振幅は、Espion E2 ソフトウェア (Diagnosys LLC、ケンブリッジ、英国) を使用して測定しました。

BN ラットの網膜光干渉断層撮影 (OCT) をベースラインおよび 12 か月目に完了しました。イメージングは、ラット網膜特有のボアを備えたBioptigen Envisu R2200 Spectral Domain OCT (Leica Microsystems、Wetzlar、ドイツ) を使用して実行されました。網膜の長方形のボリュームスキャン (1000 個の A スキャン/B スキャン、650 個の B スキャン) が取得され、インストールされている OCT リーダープラグインを使用して画像が FIJI ソフトウェアにエクスポートされ、視神経乳頭を中心とする 5 つのフレームが平均されました。次に、結果として得られた画像を OCT 反射率解析 (ORA) ソフトウェアにエクスポートし、視神経乳頭から 250 ミクロンの離心率で 10 個の縦方向反射率プロファイルで NFL から RPE までの網膜の厚さの測定値を記録しました 53。前房 OCT は、12 mm テレセントリックボア (1000 A スキャン/B スキャン、650 B スキャン) を備えた R2200 OCT で 12 か月で完了しました。キャプチャされた画像は、Bioptogen InVivoVue ソフトウェアで角膜中央の厚さと前房の深さをキャリパーで測定されました。

rAAV2.2[MAX]-mCherry を注入した全球を除核し、4% パラホルムアルデヒド (PFA) 中で 4 °C で一晩固定しました。次いで、眼をＰＢＳ中の３０％スクロース溶液に４℃で２４時間移した後、ＰＢＳですすぎ、Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ最適切断温度媒体（Ｓａｋｕｒａ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）に包埋した。次に、OCT ブロックを Leica CM1860 クライオスタット (Leica、Buffalo Grove、IL) 上で Fisherbrand Superfrost Plus スライド上に 14 μm ずつ刻み、一晩放置して乾燥させました。切片は使用するまで -20 °C で保存しました。サンプルを室温で 2 時間解凍し、OCT を PBS で洗い流し、切片を Hoechst 33342 で対比染色して核を視覚化しました。切片は、Nikon Eclipse 80i 共焦点顕微鏡 (Nikon、東京港、日本) で 20 倍の対物レンズを使用して画像化され、最大強度投影として処理され、FIJI ソフトウェアで統合されました。

CCPP 導入遺伝子ベクターを注入した全球球を 4% PFA で一晩固定し、組織を段階的エタノールで脱水し、キシレンで透明にし、パラフィン浸潤し (Sakura Tissue Tek-VIP5; 自動組織プロセッサー)、組織ブロック (Tissue Tek-TEC) に包埋しました。、埋め込みセンター）。組織ブロックを 4 µm (Microm HM355s) で切断し、ポリ-L-リジンでコーティングされたスライドにマウントしました。次に、切片をキシレンで脱パラフィンし、再水和し、自動染色プラットフォーム（Sakura Prisma）を使用してヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、ウィスコンシン医科大学小児研究所組織学コアによって開発された標準プロトコールを使用して過ヨウ素酸シフアンドマッソントリクロームについて手動で染色しました。

透過型電子顕微鏡検査用に割り当てられた各投与量グループからの全球を除核し、0.1 M カコジル酸ナトリウム緩衝液中の 2% パラホルムアルデヒド、2% グルタルアルデヒド中で 4 °C で一晩固定しました。固定に続いて、角膜、虹彩角膜隅角、および網膜前部を含むサンプルを取得するための眼球の解剖が完了し、組織を氷上の１％四酸化オスミウム中で後固定した。固定後、組織をメタノールシリーズ (50 ～ 100%) で脱水し、アセトニトリルを注入しました。次に、組織サンプルを 100% Embed 812 (Electron Microscopy Sciences、ハットフィールド、ペンシルベニア州、米国) に包埋し、60 °C で一晩ベークしました。包埋サンプルは、ウィスコンシン医科大学電子顕微鏡コアによって処理され、PowerTome MT-XL ウルトラミクロトーム (RMC Boeckeler、アリゾナ州ツーソン、米国) を使用して 70 nm 切片が作成され、200 メッシュの六角形グリッド (電子顕微鏡科学) 上に配置されました。酢酸ウラニルとクエン酸鉛で染色。染色された切片を、H-600 透過型電子顕微鏡 (Hitachi High Technologies、Schaumburg、IL、USA) で 2000 倍の倍率で画像化しました。

すべての統計分析は、グループ間の統計的有意性を決定するために、GraphPad Prism 7 (GraphPad、米国カリフォルニア州ラホーヤ) で完了しました。 Shapiro-Wilk 検定を使用して、すべてのデータセットが正常である (α = 0.05) と判定されました。対応のない T 検定を使用して、ELISA、眼房深さ、角膜厚のデータを分析しました。 Sidak の多重比較事後テストを使用した二元配置 ANOVA により、網膜厚データの有意な差が決定されました。複数の対応のない T 検定を使用して、ERG データ間の差異を決定しました。ダネットの多重比較ポストホックテストと単純な線形回帰を使用した混合効果分析を使用して、IOP データを分析しました。細隙灯データは、フィッシャーの直接確率検定を使用して分析されました。ＩＯＰ低下と炎症との間の相関関係が明らかであるかどうかを判定するために、炎症指標対１２ヶ月後のＩＯＰの単純な線形回帰を行った。さらに、炎症が IOP 低下のメディエーターであるかどうかをテストするために、各用量グループの線形回帰勾配を Tukey の多重比較検定と比較しました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

論文の結論を評価するために必要なすべてのデータは、論文および/または補足資料に記載されています。 IOP、OCT、ERG、細隙灯図の生成に使用される生データは、Figshare (https://doi.org/10.6084/m9.figshare.21280383) で入手できます。その他のリクエストは、対応する著者に通知される場合があります。

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著者らは、ウィスコンシン医科大学電子顕微鏡コアの Clive Wells 氏と Robert Goodwin 氏、組織の処理と画像化にご協力いただいた Children's Research Institute 組織学コアの Christine Duris 氏とチームに感謝の意を表します。著者らはまた、IOP 記録における協力について Amira Pavlovich に感謝したいと思います。著者らはまた、データ分析に関する意見を提供してくれたウィスコンシン医科大学の生物統計学者ライアン・コンラーディ氏にも感謝している。また、この研究を支援する資金を確保してくれたエレナ V. セミナ博士とマイケル J. ダン博士にも感謝したいと思います (国立眼科研究所賞番号 T32EY014537-EVS、国立眼科研究所- R01EY032478、国立研究資源センター) NIH 研究施設改善プログラム - C06RR016511-MJD)。

米国ウィスコンシン州ミルウォーキー、ウィスコンシン医科大学、細胞生物学、神経生物学、解剖学部

クリスティーナ・J・チャーン、クリストファー・A・リード、ダニエル・M・リピンスキー

米国ウィスコンシン州ミルウォーキーのウィスコンシン医科大学眼科・視覚科学科

クリスティーナ・J・チャーン、エミリー・R・ネッテシャイム、クリストファー・A・リード、ネイサン・W・リー、ギャビン・J・マルコ、ダニエル・M・リピンスキー

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概念化: DML および CAR 方法論: DML、CAR、ERN、および KJC 調査: CAR、ERN、KJC、NWL、および GJM 執筆 (原案): KJC および DML 執筆 (レビューおよび編集): KJC、CAR、ERN、DML 、GJM監修：DML 資金調達：DML

ダニエル・M・リピンスキーへの通信。

著者らは以下の利益を宣言します: DML と CAR は、この研究で使用される導入遺伝子 (CCPP) をカバーする特許を保有しています。 ERN、KJC、NWL、および GJM には、宣言すべき競合する利害関係はありません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Mathias Seeliger と他の匿名の査読者に感謝します。主な編集者: Chiea Chuen Khor と Eve Rogers。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

チャーン、KJ、ネッテスハイム、ER、リード、カリフォルニア他ブラウンノルウェーラットにおけるプロスタグランジンベースのrAAV媒介緑内障遺伝子治療。 Commun Biol 5、1169 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s42003-022-04134-w

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受信日: 2022 年 1 月 17 日

受理日: 2022 年 10 月 19 日

公開日: 2022 年 11 月 3 日

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遺伝子治療 (2023)

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