感染時のヒトノロウイルス抗原のマッピングにより、体液性免疫反応の幅広さが明らかに

npj ワクチン第 8 巻、記事番号: 87 (2023) この記事を引用

2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

ヒトノロウイルス (HuNoV) は、世界中で急性胃腸炎の主な原因となっています。体液性免疫応答は、HuNoV 感染の除去に重要な役割を果たしており、感染中の HuNoV の抗原状況を解明することで、ワクチン設計に役立つ抗体標的を明らかにすることができます。ここでは、HuNoV ゲノグループ GI.1 ゲノムライブラリーの Jun-Fos 支援ファージディスプレイとディープシークエンシングを利用して、GI.1 HuNoV に感染した 6 人の血清抗体のエピトープを同時にマッピングしました。我々は、非構造タンパク質と主要なキャプシドタンパク質の両方に広く分布する固有のエピトープと共通のエピトープの両方を発見しました。繰り返し発生するエピトーププロファイルは、これらの個人の間で免疫優性抗体のフットプリントが存在することを示唆しています。 3 名から縦断的に収集した血清の分析では、感染前の血清中に既存のエピトープが存在することが示され、これらの個人が以前に HuNoV 感染を有していたことが示唆されました。それにもかかわらず、新たに認識されたエピトープは感染後 7 日目に表面化しました。これらの新しいエピトープシグナルは感染前エピトープとともに感染後 180 日まで持続し、これは以前の感染および新たな感染からのエピトープを認識する抗体の持続的な産生を示唆しています。最後に、GII.4 ウイルスに感染した 3 人の血清を使用した GII.4 遺伝子型ゲノムファージディスプレイライブラリーの分析により、GI.1 アフィニティー選択で同定されたエピトープと重複するエピトープが明らかになり、GI.1/GII.4 交差の存在が示唆されました。 -反応性抗体。この結果は、ゲノムファージディスプレイとディープシークエンシングを組み合わせることで、複雑なポリクローナルヒト血清からHuNoV抗原ランドスケープを特徴づけ、感染に対するヒト体液性免疫応答のタイミングと範囲を明らかにできることを実証している。

ヒトノロウイルス（HuNoV）は胃腸炎の散発的症例と流行性感染症の発生の両方の主な原因であり、約 20 万人の死亡を引き起こし、毎年 600 億ドルの世界的な経済負担を引き起こしています1、2、3。ノロウイルス (NoV) はカリシウイルス科に属し、10 の遺伝子群 (GI-GX) と 49 の遺伝子型に分類されます。 38 の異なる遺伝子型を含む 5 つの NoV 遺伝子グループ (I、II、IV、VIII、および IX) は、ヒトに感染する可能性があります4。 HuNoV の広範な配列多様性は免疫逃避につながり、広範な防御ワクチンの開発に潜在的な障害を生み出します。

NoV ゲノムは、長さが約 7.5 キロベース (kb) の一本鎖プラスセンス RNA で、3 つのオープンリーディングフレーム (ORF) で構成されています。 ORF1 は、NS1/2 (p48)、NS3 (ヌクレオシドトリホスファターゼ、または NTPase)、NS4 (p22)、NS5 (VPg)、NS6 (プロテアーゼ)、およびNS7 (RNA 依存性 RNA ポリメラーゼ、または RdRp)。 ORF2 および ORF3 は、それぞれメジャー (VP1) およびマイナー (VP2) キャプシドタンパク質をコードします。主要キャプシドタンパク質 VP1 は、短い N 末端アーム、シェル (S) ドメイン、および突出 (P) ドメインで構成されています。 S ドメインは、NoV キャプシドアセンブリの完全性を維持します。 P ドメインは組織血液型抗原 (HBGA) に直接結合してヒト細胞に感染します 5、6。 P ドメインはさらに P1 サブドメインと P2 サブドメインに分割され、P2 サブドメインは外表面に露出しており、配列が非常に可変であるため、抗体応答からの回避が容易になります 7。マイナーキャプシドタンパク質 VP2 は、VP1 S ドメイン内の保存されたモチーフに結合します。その機能は依然として不明であるが、マウスNoV8のウイルスゲノムRNAと相互作用する。

HuNoV 感染に対する体液性免疫応答は、ウイルスの除去とその後の感染からの保護において重要な役割を果たしています6。 HuNoV 感染の排除においては、体液性免疫が T 細胞免疫よりも効果的であり、持続期間が長いことが証拠によって示唆されています9。 HuNoV に対する多くのモノクローナル抗体 (mAb) エピトープが同定されています。最近のレビューでは、307 個の固有の mAbs9 について、主に VP1 に存在する直鎖状および立体構造エピトープを描写する 70 件を超える発表された研究が要約されています。 mAb 内のエピトープのマッピングは合理的なワクチン設計にとって重要ですが、ポリクローナル体液性免疫応答全体を捕捉することはできません。ノロウイルス感染に対する体液性免疫を包括的に理解するには、ポリクローナルヒト血清中のエピトープを同定する必要があります。これまでの研究では、HuNoV感染者とワクチン試験参加者の両方から採取したポリクローナルヒト血清を評価し、これら2つのコホートにおける防御免疫と交差反応性遮断抗体の存在を判定した10、11、12、13、14、15。血清 HBGA 遮断抗体は、HuNoV 攻撃および自然感染後に増加します 10、11、12、14。さらなる研究では、二価ワクチン治験の参加者3名からの免疫前および免疫後の血清の血清学的レパートリーを調べ、広範な防御中和抗体とその交差反応性エピトープを同定しました15。それにもかかわらず、包括的な HuNoV 抗原の状況は依然として不完全です。 HuNoV エピトープの包括的なマップは、HuNoV 感染時の体液性免疫応答の系統的な図を提供します。このようなマップは、HuNoV感染中にどのようなエピトープが認識されるのか、HuNoVの抗原状況は人によって異なるのか、感染が進行するにつれて状況は変化するのか、HuNoV間に保存された免疫優性エピトープは存在するのかなどの疑問に対処できる可能性がある。

ファージディスプレイには、バクテリオファージのキャプシドの表面にペプチドまたはタンパク質を提示することが含まれます16。表示されたペプチドまたはタンパク質は、各ファージ粒子のゲノム内にコードされています。したがって、ペプチドの大きなライブラリーは、アフィニティー選択および DNA シークエンシングによって標的タンパク質への結合についてスクリーニングできます 17、18、19、20、21。感染によって誘発された抗体のエピトープをマッピングすることにより、ファージディスプレイと次世代シーケンシング (NGS) を組み合わせることで、体液性免疫応答中のエピトープの状況を高解像度で表示できます。最近、NGSと組み合わせたT7ファージプラットフォーム上に表示される206種のウイルス由来のペプチドライブラリーを使用するVirScanや汎コロナウイルスファージディスプレイライブラリーなどの技術が、新型コロナウイルス患者の血清における免疫応答のプロファイリングに利用されている。 SARS-CoV-222、23、24に対する免疫応答を調査するため。

我々は以前、HuNoV25に対するscFv抗体およびポリクローナルウサギ血清のエピトープを同定するために、ディープシークエンシングと組み合わせたHuNoVゲノムファージディスプレイライブラリのファージディスプレイアフィニティー選択を実行しました（図S1）。この新しい研究では、HuNoVに感染した個体のヒト血清に対してディープシークエンシングと組み合わせたアフィニティー選択を実行することにより、HuNoV感染に対する体液性免疫応答のレパートリーを特徴付けることを目的としました。 GI.1 Norwalk ゲノムファージディスプレイライブラリーと新しく構築された GII.4 HOV ゲノムファージディスプレイライブラリーを使用して、感染後の単一時点で 9 つのポリクローナルヒト血清のプロファイリングを行いました。さらに、感染前と感染後の複数の時点で、3 人の血清について縦断的研究を実施しました。非構造タンパク質 NS1/2 (p48)、NS3 (NTPase)、NS4 (p22)、NS5 (VPg)、NS6 (プロテアーゼ)、NS7 (RdRp) のエピトープと、VP1 メジャーの交差反応性エピトープを同定しました。 GI.1 Norwalk または GII.4 HOV に固有のキャプシドタンパク質。抗原の状況は個人によって異なりますが、共通の反復エピトープも含まれていることを観察しました。また、感染過程における個人のエピトーププロファイルの変化も調べました。これらの研究により、感染前の血清中にエピトープが存在することが明らかになり、この個体が以前にHuNoV感染を起こしていたことが示されました。感染後 7 ～ 30 日で、非構造タンパク質と構造タンパク質に新しいエピトープが発生しました。これらのエピトープのほとんどは、感染前の血清で検出されたエピトープと同様に、感染後 180 日間持続しました。最後に、GI.1 Norwalk と GII.4 HOV に共通のエピトープを検出し、遺伝子グループ間で交差反応する抗体の存在を確認しました。我々の結果は、ファージディスプレイとディープシークエンシングを組み合わせることで、複雑なポリクローナルヒト血清中のエピトープを首尾よく特徴付けることができ、HuNoV免疫応答のより深い理解を提供し、これがHuNoV感染症のスクリーニング方法や広範な防御ワクチンの開発に役立つ可能性があることを示している。

以前に、我々はGI.1剪断ゲノムファージディスプレイライブラリを構築し、それをヒトscFV抗体のエピトープのマッピングに利用しました25（図S1）。このライブラリーは、GI.1 ウイルス様粒子 (VLP) に対して生じたウサギポリクローナル抗血清から複数のエピトープを同時にマッピングするためにも使用されました 25。この GI.1 ゲノムライブラリーを作成するために 450,000 を超えるクローンがプールされました。NGS によって、このライブラリーは、GI.1 オープンリーディングフレームの優れたカバー率を示すインサートを備え、非常に多様であることが示されました 25。

この研究では、HuNoV 感染の抗原状況をマッピングするために再び GI.1 ライブラリを利用しました。ナイーブライブラリーの挿入領域のNGSを繰り返すことにより、ライブラリー内のインサートの多様性を検証し、ライブラリーの高い多様性を確認しました（図1a、b）。断片化された DNA をファージディスプレイプラスミドにクローニングすると、GI.1 ゲノムに対して順方向または逆方向の挿入が生じます。順方向挿入のみがインフレーム HuNoV ペプチドをコードすることに注意してください。ライブラリーに存在する合計 700 万個の順方向鎖インサートと 900 万個の逆方向鎖インサートを数えました。インサートを参照ゲノムとアライメントして、ヌクレオチドごとのカバレッジスコアを取得しました 26,27。カバレッジスコアは、参照ゲノムにアラインメントされたフォワードインサートとリバースインサートの両方のプールにおける各ヌクレオチド位置の出現数として計算されました (図 1c)28。結果は、順鎖と逆鎖の両方で、HuNoVゲノムを含むプラスミドのすべてのヌクレオチド位置に複数のインサートが存在することを示し、インサートによるゲノムの優れたカバー率をさらに示しました（図1c）。インサートのサイズ分布も計算され、インサートが長さ10〜170アミノ酸の範囲のペプチドをコードし、平均インサートが47アミノ酸をコードしていることが示されました（図1d）。広範囲のペプチド長およびその連続分布は、線状エピトープと立体構造エピトープの両方がライブラリー内のインサートによってコードされていることを示唆しています。

a pKS-NV68 KM プラスミド内の位置にマッピングされたナイーブライブラリー内の順方向鎖インサート (赤色) の分布。ｐＫＳ－ＮＶ６８ＫＭプラスミドにおけるインサートの５'末端の位置はｘ軸に示され、インサートの３'末端の位置はｙ軸に示されている。挿入の出現数は、z 軸上のカウントとして定義されます。 b ナイーブライブラリーにおける逆鎖インサート (黒) の分布。 c DNA 配列アラインメントによって定義されるナイーブライブラリの範囲。合計 7,498,441 個の順方向鎖インサートと 9,481,435 個の逆方向鎖インサートをアライメントして、ヌクレオチド位置ごとのカバレッジスコアを生成しました。カバレッジスコアは、それぞれ順方向鎖インサートおよび逆方向鎖インサートについて整列されたDNAインサート断片のセットにおける各ヌクレオチド位置の出現数として定義された。 pKS-NV68 KM の順方向鎖インサートのカバレッジスコア (赤色) は x 軸の上に示され、逆方向鎖インサートのカバレッジスコア (灰色) は x 軸の下に示されます。 d ナイーブライブラリーにおけるペプチドサイズの分布。それぞれの固有のペプチドの頻度が Y 軸に示され、ペプチドのサイズが X 軸に示されます。

感染中のHuNoVに対する抗体応答をプロファイリングするために、GI.1感染者の血清サンプルをGI.1ゲノムファージディスプレイライブラリーのアフィニティー選択に使用しました。 GI.1 HuNoV に感染した 6 人の血清をスクリーニングしました。これらの血清は、以前の研究の一部として収集されました 29,30。アフィニティー選択は、感染後 14 日目に 4 名、感染後 30 日目に 2 名の血清に対して行われました。アフィニティー選択は、最初にプロテイン A/G 磁気ビーズを使用して血清中に抗体を固定化することによって実行されました。結合を可能にするために、ナイーブファージライブラリーを固定化抗体に添加しました。 2 ラウンドのアフィニティー選択の後、結合したファージが溶出され、挿入領域が PCR 増幅されました。 PCR産物に対してディープシーケンシングを実行し、HuNoV ORFを含むプラスミド配列とアラインメントした際のインサートの分布を評価しました（図1）。個人 715 の結果を図 2 に示し、6 人全員の結果を図 S2 に示します。

x 軸はインサートの 5' 末端、y 軸はインサートの 3' 末端、z 軸は出現数を示します。インサートクラスターの分布は、a NS1/2 (p48)、b NS3 (NTPase)、c NS4 (p22)、d NS5 (VPg)、e NS6 (プロテアーゼ)、および f NS7 ( RdRp）。

エピトープは、カウント数が血清中の抗体による濃縮の程度に比例するという前提のもと、HuNoV ゲノムにマッピングされたカウント数として表現されたインサートの分布に基づいたディープシークエンシングデータから同定されました 25,27。感染者からの血清を用いた2ラウンドのアフィニティー選択後のインサートおよび関連するカバレッジスコアの分布は、VP1キャプシドタンパク質およびいくつかの非構造タンパク質に位置するエピトープを表す広範囲のシグナルを示しました（図S2）。

ゲノムファージディスプレイライブラリーは、ランダムに切断されたゲノム DNA をファージディスプレイプラスミドに連結することによって構築されました。ゲノムインサートはどちらの方向 (順方向または逆方向) および 3 つのリーディングフレームのいずれでもよいため、ナイーブライブラリーのインサートの大部分はフレーム外にあり、HuNoV ペプチドを生成しません。アフィニティー選択により血清中の抗体によって認識される HuNoV ペプチドが濃縮されている場合、フレーム内ペプチドをコードするインサートの頻度はその後の選択ラウンドで増加するはずですが、フレーム外配列をコードするインサートは排除されるはずです。図S3aに見られるように、ランダムインサートの予想どおり、ナイーブライブラリーのインサートの約20％がインフレームペプチドをコードしていますが、選択のラウンド2までに、インサートの70〜90％がインフレームペプチドをコードしていることが判明しましたペプチドとフレーム外配列をコードする挿入部分は大部分が除去されました。これらの結果は、アフィニティー選択により、血清中に存在する抗体に結合するHuNoV配列、すなわちエピトープが豊富であることを示している。また、各カウント数のフレーム内挿入の割合も分析しました。図 S3b は、各挿入カウントグループのナイーブライブラリーのインフレームインサートの割合が一貫して 20% に留まったことを示しています。これは、インフレームインサートの合計割合について観察されたものと同じです。また、選択後のライブラリー内のフレーム内インサートの頻度は、カウントが 5 のインサートで増加し始めることが観察されました。これは、カウントが 5 以上のフレーム内インサートが、アフィニティー選択によって濃縮されたペプチド、つまりエピトープをコードしていることを示唆しています。したがって、ナイーブライブラリーについて上述したように、選択後のライブラリー内でカウントが 5 以上のインフレームインサートを選択して、ヌクレオチド位置ごとのカバレッジスコアを計算しました。

配列決定の深さと、各エピトープを構成する配列が血清中の抗体によってどのように繰り返し濃縮されるかを説明するために、研究参加者715のカバレージマップを例として図7および8に示す。 3とS4。カバレッジマップは、ORF1 のエピトープが NS1/2 (p48)、NS3 (NTPase)、NS4 (p22)、NS5 (VPg)、NS6 (プロテアーゼ)、および NS7 (RNA) のインフレームアミノ酸配列として位置していることを示しています。依存性 RNA ポリメラーゼ、または RdRp)。カバレッジマップは、VP1 キャプシドタンパク質内のエピトープの存在も示しています (図 3 および S4 では標識されていません)。カバレッジスコアによって明らかにされたエピトープは、高いカバレッジスコアの領域に関連する配列を整列させて単一アミノ酸分解能でエピトープを正確に定義することにより、より高い分解能で解析できます（図3およびS4）。例えば、NS4に関連する配列のアラインメントにより、100アミノ酸のエピトープが明らかになった。線状エピトープは 20 アミノ酸未満の長さであるため 31、NS4 エピトープは立体構造的である可能性があります (図 3、S4、表 S1)。この個人のカバレージスコアが高い領域の配列のアラインメントにより、図3および表S1に見られるように、他のエピトープの高解像度の定義も同様に提供されました。総合すると、これらの結果は、アフィニティー選択とディープシーケンシングのアプローチにより、単一のポリクローナル血清サンプルから複数のエピトープを同時に高分解能で同定できることを示しています。

被験者 715 からの血清を用いた 2 ラウンドのアフィニティー選択後のインサートのカバー率を、GI.1 ORF を含むプラスミドに対する DNA 配列アラインメントによって決定し、左側に示します。ヌクレオチドごとのカバレージスコアが Y 軸に示され、プラスミド配列上の位置が X 軸に示されます。 HuNoV ORF 1 ～ 3 の位置を参考として x 軸の下に示します。フォワードストランドインサートのみが示されている。 NS6 (プロテアーゼ) の濃縮ペプチドのアラインメントを右側に示します。アラインメントの上部の番号は、非構造タンパク質内のアミノ酸残基の位置を示します。 Jalview Zappo カラースキームが使用されており、脂肪族/疎水性残基 (I、L、V、A、および M) は桃、芳香族残基 (F、W、および Y) は金、正に帯電した残基 (K、R、および H) は青色、負に帯電した残基 (D および E) は赤色、親水性残基 (S、T、N、および Q) は緑色、構造的に特殊な残基 (G および P) はマゼンタ、システインは黄色です。カバレッジマップで左から右に並べられたペプチドファミリーは、NS1/2 (p48)、NS3 (NTPase)、NS4 (p22)、NS5 (VPg)、NS6 (プロテアーゼ)、および NS7 の抗 GI.1 エピトープを定義します。 (RdRp)。

次に、HuNoV 感染によって誘発された抗体のエピトープの分布を異なる個体間で比較しました。これは、カバレッジスコアマップを比較して、6 人の個人のコホート間で共有される固有のエピトープを検出することによって達成されました。潜在的なエピトープを含むウィンドウ内のフレーム内インサートの割合を、ナイーブライブラリ内のフレーム内インサートの割合と比較することによって、エピトープをさらに検証した。アフィニティー選択後のライブラリーのフレーム内挿入頻度が、所定のウィンドウ内でナイーブライブラリーのフレーム内挿入頻度よりも高ければ、エピトープの存在が確認されます (図 4)。

a ナイーブライブラリーのインサート（上）、および対象 715、720、723、731、732、および 750 からの血清を用いた 2 ラウンドのアフィニティー選択後のインサートのカバー率は、以下を含むプラスミドに対する DNA 配列アラインメントによって決定されました。 GI.1 ORF。ヌクレオチドごとのカバレージスコアが Y 軸に示され、プラスミド配列上の位置が X 軸に示されます。 HuNoV ORF 1 ～ 3 の位置を参考として x 軸の下に示します。フォワードストランドインサートのみが示されている。 b 被験者 715、720、723、731、732、および 750 からの血清を用いた 2 ラウンドのアフィニティー選択後の、ナイーブライブラリーの ORF2 のインフレームインサートの割合とインフレームインサートの割合。GI に沿った 8 アミノ酸のスライディングウィンドウ.1 ORF2 を x 軸に示し、ナイーブライブラリー (黒いバー) および 2 ラウンドのアフィニティー選択後のライブラリー (赤いバー) のフレーム内インサートの割合を y 軸に示します。

非構造タンパク質の 13 個のエピトープを同定しました。 NS1/2 には 3 つの顕著なエピトープが複数の個体で見つかります。アラインメントは、エピトープがORF1のアミノ酸位置131〜190、248〜282、および315〜355にマッピングされ、それぞれ1人、2人、1人の個体で見つかったことを示しています（図4a、5、表S1）。別の 3 つの顕著なエピトープは NS3 にあり、位置 406 ～ 448、498 ～ 554 にあり、それぞれ 1 人の個体で見つかり、697 ～ 743 の位置は 2 人の個体で見つかります。 7 番目のエピトープは、NS4 の N 末端ドメイン (NTD) の ORF1 の 759 ～ 858 位をカバーする 100 アミノ酸長です。前述したように、この配列の長さは、それが立体構造エピトープであることを示唆しています。このエピトープは 5 人の個体で見つかりました。 8 番目のエピトープは NS5 の 987 ～ 1037 位にあり、6 人全員で見つかりました。 9 番目のエピトープは NS6 にあります。このエピトープは 5 人で見つかり、1095 位から 1180 位までの 86 残基にわたる。NS7 では 4 つのエピトープが同定され、ORF1 の 1311 ～ 1353、1488 ～ 1539、1577 ～ 1653、および 1709 ～ 1780 位に位置し、長さは 43 である。、52、77、および72アミノ酸。最初の 2 つの NS7 エピトープは 2 人の個体で見つかり、3 番目のエピトープは 1 人の個体で見つかり、最後のエピトープは 4 人の個体で見つかりました (図 4a、5、表 S1)。配列の長さは、それらが立体構造エピトープであることを示唆しています。

樹状図は、6 人の個人に共有されるエピトーププロファイルを比較します。ピンクのブロックは、指定された非構造タンパク質ドメインまたは構造タンパク質ドメイン内の各個体のエピトープを示します。

VP1 のエピトープを同定するために、ORF2 を 24 ヌクレオチド、つまり 8 アミノ酸残基の長さの 67 のウィンドウに分割しました。 ORF1 でエピトープを定義した方法と同様に、選択後のライブラリーとナイーブライブラリーのインフレームインサートの頻度を比較しました。選択したライブラリーのインフレームインサートの頻度が、所定の 8 mer ウィンドウ内のナイーブライブラリーのフレーム内インサートの頻度よりも高い場合、ウィンドウ内でインサートを整列させてエピトープを同定しました。全体として、VP1 には 35 のエピトープが同定され、そのうち 19 が S ドメインに、12 が P1 サブドメインに、4 が P2 サブドメインにありました。非構造タンパク質で見つかったエピトープと同様に、ほとんどのVP1エピトープは2人以上の個体間で共有され、6人全員に5つのエピトープが存在し、これらのエピトープが高い免疫原性を示すことが示唆されました（図4b、5、表S1）。

S ドメインには 19 個のエピトープがあり、長さは 12 ～ 35 残基の範囲です。また、HJT-R3-A9 scFv 抗体によって認識される 3 つのエピトープもマッピングしました。長さに基づいて、これらの配列の大部分は線状エピトープであるように見えます。我々は、P ドメイン内に長さ 8 ～ 38 残基の範囲の 16 個のエピトープを同定しました。これらの配列の大部分は長さが 20 残基未満であり、それらが線状エピトープであることを示唆しています (図 4b、5、表 S1)。

エピトープの大部分は少なくとも 2 人の個体で見つかりましたが、各個体のエピトープの配置は独特です。つまり、まったく同じエピトープのセットを持つ個体は 2 人もいないということです。これらの結果は、認識されたエピトープのセット間の個人間の類似性を示す樹状図で最もよく視覚化されます (図 5)。たとえば、樹状図は、個人 731、750、および 732 は非常に類似したエピトープのセットを有し、したがって同様の抗体応答を有する一方、個人 720 および 750 は感染に対してより多様な抗体応答を有することを示しています。また、感染後 30 日目に血清を採取した個体 731 および 732 の VP1 では、感染後 30 日目に血清を採取した他の 3 個体 (715、720、および 723) と比較して、より多くのエピトープが観察されることにも注目することは興味深いことです。感染後 14 日目 (図 4、5)。

まとめると、結果は、抗原の状況には非構造タンパク質と構造タンパク質のすべてが含まれており、各人のポリクローナル血清には、線状および立体構造エピトープの独自の集合に対する抗体が含まれているにもかかわらず、これらのエピトープは個人のセットの間で広く共有されていることが示されました。

以前の研究では、HuNoV 感染に対する防御免疫は 4.1 年から 8.7 年の範囲であると推定されています 32,33,34。しかし、感染症全体を通して体液性免疫に関連する抗原の状況は不明です。したがって、我々は、複数の個体におけるHuNoV感染の過程における抗体応答に関連するエピトープ状況の縦断的研究を実施した。この目的のために、研究対象者 731、732、および 750 の 5 つの異なる時点を含む、180 日間にわたって収集された血清を調査しました。5 つの時点には、感染前、感染後 7、14、30、および 180 日が含まれます。各時点での 2 ラウンドのアフィニティー選択後に得られた挿入数の分布とカバレッジスコアにより、HuNoV ORF に沿ったエピトープが明らかになりました。明確にするために、非構造タンパク質のエピトープのみを標識しました。研究参加者のそれぞれは、感染前血清中にHuNoVの定義されたエピトープを認識する抗体を有しており、これは彼らが以前にHuNoVに感染していたことを示している（図6、S5）。これらの既存のエピトープは、選択されたライブラリーのインフレームインサートの割合がナイーブライブラリーよりも大きいことを確認することによって検証されました。個体 731 で特定されたエピトープはすべて既存のものであり、それらの大部分は感染の全過程を通じて存続しました。対象７３２では感染後に出現した３つのエピトープがあり、これらはＮＳ１／２、ＮＳ５、およびＮＳ６における最初のエピトープであり、対象７５０では感染後に出現した１つのエピトープ（ＮＳ７における最初のエピトープ）があった（図２、３、４）。 6、S5）。被験者 732 と 750 の残りのエピトープは以前から存在していました。

被験者731、732、および750から異なる時点で収集した血清による2ラウンドのアフィニティー選択後のインサートの被覆率を、GI.1 ORFを含むプラスミドに対するDNA配列アラインメントによって決定した。ヌクレオチドごとのカバレージスコアが Y 軸に示され、プラスミド配列上の位置が X 軸に示されます。 HuNoV ORF 1 ～ 3 の位置を参考として x 軸の下に示します。フォワードストランドインサートのみが示されている。 a チャレンジ前、およびチャレンジ後 7、14、30、および 180 日後の対象 731 血清による 2 ラウンドのアフィニティー選択後のインサートのカバー率。 b 攻撃前、および攻撃後7、14、30、および180日後の対象732血清による2ラウンドのアフィニティー選択後のインサートの範囲。 c チャレンジ前、およびチャレンジ後 7、14、30、および 180 日後の対象 750 血清によるアフィニティー選択の 2 ラウンド後のインサートのカバー率。点線は感染前の血清から感染後 180 日まで存続する既存のエピトープを表し、実線は感染後に出現するエピトープを表します。

感染後に生じたエピトープのうち、NS5 のエピトープは 3 人全員で濃縮の増加を示し、被験者 731 と 750 では 14 日目と 30 日目に、被験者 732 では 14 日目に最高のカバレッジスコアに達しました。 NS4 と NS6 のエピトープ被験者 732 についても、感染後 14 日から 180 日までの時点でより高い濃縮が示されました。これは、NS4、NS5、および NS6 のエピトープの組み合わせを標的とする免疫応答が、さまざまな個人の感染開始時に誘導されたことを示しています。最後に、感染後 180 日までに、インサート数とカバレッジスコアは、大部分のエピトープについて HuNoV 攻撃前に観察されたベースラインのエピトープ状況に戻りました。具体的には、適応応答の一部として感染後に誘導された抗体も、180日目でも残存していた(すなわち、被験者732のNS4およびNS6)。全体として、これらの結果は、エピトープの状況が個人によって異なり、HuNoV感染中に存在する抗体が、おそらく以前の感染から生じた既存の抗体とHuNoV攻撃によって誘導された新しい抗体の組み合わせであることを示しています。これらの既存の持続性抗体は、これらすべての個体が抗体の存在下で感染したため、明らかに感染からの保護を提供しなかったことは注目に値する。

ノロウイルスは遺伝的に多様であり、配列同一性に基づいて大まかに 10 の異なる遺伝子グループに分類され、さらに 49 の遺伝子型に細分されます。理想的には、ノロウイルスワクチンは、遺伝子群および遺伝子型全体で保存されているエピトープを標的とします。 GII.4 HuNoV は、過去 15 年間の世界中での流行の大部分の原因となっています35、36、37。また、小児では集中的な治療が必要となる、より重度の症状も引き起こします38。 HuNoV に対する免疫応答の交差反応性および GII.4 ノロウイルスの抗原状況をさらに理解するために、GI.1 について説明したのと同じ方法を使用して、GII.4 HOV 断片化ゲノムファージディスプレイライブラリーを作成しました。図書館。 GII.4 HOV ナイーブライブラリーのディープシークエンシングにより、GII.4 HOV ORF を含むプラスミド配列に沿ったフォワードインサートとリバースインサートの両方が高密度に分布していることが明らかになりました（図 7a、b）。約800万個の順方向インサートと500万個の逆方向インサートをアライメントして、ヌクレオチドごとの位置カバレッジスコアを取得しました（図7c）。結果は、ライブラリーの構築に使用された GII.4 HOV ゲノムを含むプラスミドのすべてのヌクレオチド位置で優れたカバー率を示しました。インサートによってコードされるペプチドサイズの分布は、約10〜180アミノ酸の範囲であり、平均サイズは58アミノ酸である（図7d）。 GI.1 ライブラリーと同様に、GII.4 HOV ライブラリーにはペプチドサイズが連続的に分布しており、インサートサイズが非常に多様であることが示されています。

a GII.4 HOV ORF を含むプラスミド内の位置にマッピングされたナイーブライブラリー内の順方向鎖インサート (赤色) の分布。プラスミド内のインサートの5'末端の位置はx軸に示され、インサートの3'末端の位置はy軸に示されている。挿入の出現数は、z 軸上のカウントとして定義されます。 b ナイーブライブラリーにおける逆鎖インサート (黒) の分布。 c DNA 配列アラインメントによって定義されるナイーブライブラリの範囲。合計 8,364,766 個の順方向鎖インサートと 5,535,252 個の逆方向鎖インサートをアライメントして、ヌクレオチド位置ごとのカバレッジスコアを生成しました。カバレッジスコアは、それぞれ順方向鎖インサートおよび逆方向鎖インサートについて整列されたDNAインサート断片のセットにおける各ヌクレオチド位置の出現数として定義された。プラスミドの順方向鎖インサートのカバレッジスコア (赤) は x 軸の上に示され、逆方向鎖インサートのカバレッジスコア (灰色) は x 軸の下に示されます。 d ナイーブライブラリーにおけるペプチドサイズの分布。それぞれの固有のペプチドの頻度が Y 軸に示され、ペプチドのサイズが X 軸に示されます。

血清抗 GII.4 シドニー 2012 抗体レベルが高い 3 人の血清に対して GII.4 HOV ライブラリを使用してアフィニティー選択を実行しました。そのうちの 1 人 (BCM16-1) は最近 GII.4 シドニー 2012 ウイルス感染症を患っていました。さらに、GI.1 VP1 に結合する scFv HJT-R3-A9 抗体およびウサギ抗 GI.1 VLP 抗血清に対する GII.4 HOV ライブラリーを使用してアフィニティー選択を実行しました。 GII.4 HOV ナイーブライブラリー内のインフレーム HuNoV ペプチドをコードするインサートの頻度と、各ラウンドのアフィニティー選択後の頻度を評価しました。図S6aは、GI.1ライブラリーを使用したラウンド1から2へのアフィニティー選択の進行と同様に、血清抗体に結合するHuNoV配列が濃縮されたアフィニティー選択を示しています。図 S6b に示すように、各カウント数のフレーム内挿入の割合も、カウント 5 の挿入で増加し始めましたが、GI.1 の結果ほど明らかではありませんでした。カウントが 5 以上のインサートを使用して、ヌクレオチド位置ごとのカバレッジスコアを計算しました。

GII.4 HOV ライブラリー選択のディープシーケンシング後に生成されたインサート数とカバレッジマップにより、NS1/2 (p48)、NS3 (NTPase)、NS4 (p22)、NS5 (VPg)、NS6 (プロテアーゼ) に位置するエピトープが明らかになりました。、および NS7 (RdRp) (図 8、S7、表 S2)。 3 人全員の血清から NS1/2 にマッピングされたエピトープは、ORF1 の残基 68 から 113 のエピトープを共有します。 NS3 のエピトープも 3 人全員に共有されており、長さは 81 残基 (395 ～ 475) であり、これが立体構造エピトープであることを示唆しています。 NS4 のエピトープも 3 人全員に 78 残基 (702 ～ 779) の配列で出現しました。 NS5 のエピトープには NS4 の C 末端と重なる 2 つの残基があり、3 人全員に出現しました。このエピトープには 69 残基 (872 ～ 942) の共通配列があり、それが立体構造エピトープであることを示唆しています。最後に、NS6 のエピトープは NS5 と重複しており、NS6 も 3 人全員で共有されており、ORF1 の 982 位から 1029 位に位置しています。最後のエピトープは対象 BCM16-1 にのみ存在し、NS7 に存在します。このエピトープは 64 残基長 (1220 ～ 1283) であり、やはり立体構造エピトープを示唆しています (図 8、S7、表 S2)。

a ナイーブライブラリーのインサートのカバー率（上）、および被験者由来の血清による 2 ラウンドのアフィニティー選択後のインサート BCM16-1 血清、BCM13-1 血清、BCM16-2 血清、抗 NV ウサギポリクローナル抗体、ＨＪＴ－Ｒ３－Ａ９ｓｃＦｖ抗体は、ＧＩＩ．４ＨＯＶＯＲＦを含むプラスミドに対するＤＮＡ配列アラインメントによって決定された。ヌクレオチドごとのカバレッジスコアが Y 軸に示され、プラスミド上の位置が X 軸に示されます。 GII.4 HOV ORF 1 ～ 3 の位置を参考として x 軸の下に示します。フォワードストランドインサートのみが示されている。 b 被験者由来の血清BCM16-1、BCM13-1、BCM16-2、抗NVウサギポリクローナル抗体、およびHJTによる2ラウンドのアフィニティー選択後のナイーブライブラリーのORF2のインフレームインサートとインフレームインサートの割合GII.4 HOV ORF2 の -R3-A9 scFv 抗体。 GI.1 ORF2 に沿った 8 アミノ酸のスライディングウィンドウが x 軸に示され、一方、ナイーブライブラリー (黒色のバー) および 2 ラウンドのアフィニティー選択後のライブラリー (赤色のバー) のインフレームインサートの割合が x 軸に示されます。 y 軸。

これらの標的に対する GII.4 HOV ライブラリーのアフィニティー選択でも、VP1 からの配列の濃縮が示されました。 GI.1 実験と同様に、ORF2 を 24 ヌクレオチドまたは 8 残基長の 68 ウィンドウに分割し、各ウィンドウで選択したライブラリーとナイーブライブラリーのインフレームインサートの頻度を比較しました。選択後のインフレームインサートは、ナイーブライブラリーのものよりも高い頻度でアラインメントされ、エピトープを同定した。 VP1 では、S ドメインに 10 個、P1 サブドメインに 4 個、P2 サブドメインに 4 個の合計 18 個のエピトープを同定しました。 6 人は固有のエピトープを持っていました。 2 つ以上のエピトープを持った 30 人のうち、S ドメインの NTD に 5 つのエピトープが 6 人全員に存在し、これら 5 つのエピトープが免疫原性が高いことを示唆しています。 (図8、表S2)。 3 人の血清、A9 抗体、抗 NV ウサギ血清のエピトーププロファイルが樹状図に示されています。これは、A9 抗体と抗 NV 血清間の免疫プロファイルが最も類似していることを示しています。血清間のプロファイルはより密接に関連しており、BCM16-1 と BCM16-2 は最も類似したエピトーププロファイルを持っています (図 S8)。

全体として、GII.4 シドニー感染者の血清に対する GII.4 HOV ライブラリーを使用して同定されたエピトープは、GI.1 感染者の血清に対する GI.1 ライブラリーの選択で観察されたエピトープよりも少なかった。これはおそらく、異なる GII.4 遺伝子型に感染した個体からの血清に対する GII.4 HOV ライブラリーの使用によるものと考えられます。さらに、GII.4 血清は自然感染によるものであり、感染から血清採取までのタイムラインは不明です。血清採取のタイミングは、観察されるエピトープに影響を与えると予想されます。

個体は GII.4 HOV 2002 に感染しておらず、A9 抗体と抗ウサギ VLP 血清は GI.1 および GII.4 エピトープを同定することが示されたため、GII.4 HOV ライブラリーのアフィニティー選択から同定されたエピトープとこれらのエピトープは一致しませんでした。ターゲットは、GI.1 と GII.4 の両方を認識する交差反応性抗体になります。交差反応性エピトープを特定し、エピトープ内の配列保存レベルを決定するために、GI.1 および GII.4 HOV エピトープの配列をアラインメントし (図 S9a)、GI.1 間の同一性パーセント (PI) を計算しました。 GII.4 HOV エピトープ配列。アライメントにより、NS7 エピトープがすべてのエピトープの中で最も高い PI 値 (81.4%) を持つことが明らかになり (図 S9a)、このエピトープが遺伝子群間で最も保存されていることを示しています。最も低い PI 値 (27.5%) を持つエピトープは NS1/2 のエピトープです。 VP1 内で、最も高い PI 値 (79.5%) を持つエピトープは S ドメイン、つまり図 S9a の 11 番目のエピトープにあります。 PI 値が最も低いエピトープ (31.6%) は、S ドメインの NTD、または S9a の 7 番目のエピトープにあります。非構造タンパク質および構造タンパク質のほとんどの交差反応性エピトープが高レベルで保存されていることから、それらが HBGA 遮断特性を示す場合には、広範な防御ワクチンに組み込まれる可能性が示唆されます。さらに、ノロウイルス感染を検出するための広範な反応性の診断ツールとしても使用できる可能性があります（図S9）。最後に、タンパク質BLASTを使用して、ここで特定されたノロウイルスエピトープの配列を検索しましたが、ノロウイルス以外のウイルスとの高い配列類似性一致は特定されませんでした。したがって、我々が同定したエピトープに結合する抗体は、ノロウイルスに特異的である可能性が高い。

総合すると、GI.1 および GII.4 HOV 感染後血清、抗 NV 血清、および scFv HJT-R3-A9 抗体の結果は、ディープシークエンシングと組み合わせたファージディスプレイアフィニティー選択が複雑なポリクローナルヒトに対して使用できることを示しました。血清を使用して複数のエピトープを同時に同定します。我々のデータにより、非構造タンパク質および構造タンパク質において 48 個の GI.1 および 24 個の GII.4 HOV エピトープが同定されました。感染者間で同様のエピトーププロファイルが同定されましたが、固有のエピトープも存在しました。また、感染の過程でエピトープが変化することも観察され、これは適応免疫応答の動的な性質を示しています。最後に、GI.1 および GII.4 HOV にわたって交差反応する抗体を観察しました。交差反応性抗体によって認識される 10 個のエピトープは、ノロウイルス感染を検出するためのワクチンまたは診断ツールに組み込まれる可能性があります。

ここで我々は、Jun-Fos支援ファージディスプレイとディープシークエンシングを組み合わせることで、複雑なポリクローナルヒト血清から複数のエピトープを同時にマッピングできることを示した。我々は、GI.1 および GII.4 HOV ゲノムライブラリーでこのアプローチを利用し、HuNoV 感染者の 9 つの複雑なポリクローナルヒト血清と、3 人の感染者の 5 つの時点からの 15 血清の縦断的コレクションのエピトープランドスケープを決定しました。私たちのデータは、非構造タンパク質と構造タンパク質の両方のエピトープを含む、各個人の複数の GI.1 エピトープを明らかにしました。縦断血清サンプルを使用して、すべての個体が既存のエピトープと、攻撃 GI.1 感染に起因する適応免疫応答による新しいエピトープを持っていることを観察しました。さらに、GI.1 血清と GII.4 血清の両方からのエピトープのマッピングにより、交差反応性エピトープの同定が可能になりました。まとめると、結果は HuNoV 感染に対する体液性免疫応答についての洞察を提供します。

主要構造タンパク質 VP1 で構成されるウイルス様粒子 (VLP) は免疫原性が高く、その免疫原性とエピトーププロファイルがよく研究されているため、ワクチン候補となっています 39。対照的に、HuNoV 非構造タンパク質の免疫原性とエピトープの状況は十分に特徴づけられていません。しかし、免疫学的スクリーニングから単離された NS3 の C 末端 (NTPase) および NS4 の N 末端 (p22) に位置する発現クローンは、GI.1 ノロウイルス感染後血清と反応することが示されています 40。別の報告では、GI.1 ノロウイルスに感染した個体は、VPg、プロテアーゼ、および RdRp41 で構成される非構造融合タンパク質 VPR に対する血清反応を示したことが示されました。さらに、ヨーロッパ全土の小児におけるHuNoVに対する体液性免疫反応を調査した最近の研究では、NS1/2 (p48) および NS4 (p22) の抗原性が報告されています42。私たちの研究は、上記に挙げたものを含む複数の非構造タンパク質のエピトープの同定を通じて、非構造タンパク質の免疫原性についての理解を大幅に拡大します。具体的には、非構造タンパク質において 13 個の GI.1 エピトープと 6 個の GII.4 HOV エピトープを同定しました。

タンパク質構造上のエピトープの位置は、これらのエピトープに結合する抗体が中和活性を有するかどうかについての手がかりを提供します。 NS6 (プロテアーゼ) および NS7 (RdRp)7、43、44、45、46 の X 線構造、マウスノロウイルス VPg の核磁気共鳴 (NMR) 分析、および HuNoV VPg 47、48 の相同性モデルが利用可能です。 HuNoV NS5 (VPg) はウイルス RNA ゲノムの 5' 末端に共有結合し、ウイルス RNA 複製の開始に関与します。 GI.1（984-1037）およびGII.4 HOV（872-942）（図S9）の交差反応性NS5エピトープは、VPgの構造化ヘリックスコアにマッピングされ、重要なチロシン残基（GI.1のY992）を含みます。これは、これらのエピトープに結合する抗体がウイルスの RNA 複製ステップを直接阻害できることを示唆しています 47。

また、GI.1 および GII.4 HOV の両方で HuNoV NS6 (プロテアーゼ) のエピトープも同定しました。 GI.1 血清から検出された NS6 エピトープ (1095 ～ 1180) は、活性部位 (H1130 および E1154) の重要な触媒残基を含むプロテアーゼの裂け目にマッピングされます (図 9a)43,49。したがって、このエピトープを標的とする抗体は、NS6 の触媒活性を阻害する可能性があります。 GII.4 HOV NS6 エピトープ (図 9b) は最初の 21 残基にマッピングされ、プロテアーゼの活性部位は含まれません 43。

GI.1 Norwalk および GII.4 HOV NS6 (プロテアーゼ)、GI.1 NS7 (RdRp)、GI.1 VP1、および GII.4 HOV VP1 構造上のエピトープの位置。左から右に、a GI.1 NS6 構造 (PDB ID: 2FYQ)、b について、y 軸上で反時計回りに 90 度回転した 4 つの表面図と、x 軸上で反時計回りに 90 度回転した 2 つの表面図を示します。 GII.4 HOV NS6 構造 (PDB ID: 6NIR)、c GI.1 NS7 構造 (PDB ID: 4NRT)、および d GI.1 VP1 (PDB ID: 1IHM)、e GII.4 VP1 (PDB ID: 7MRY)エピトープの位置。

我々は、ウイルス RNA の複製を担う GI.1 NS7 タンパク質 (RdRp) 内の 4 つのエピトープを同定しました。 4 つの GI.1 NS7 エピトープのうち 2 つは手のひら領域の NS7 の活性部位 (D1522、D1623、D1624)50,51 と重複しており、別のエピトープには親指領域の残基 (I1721、S1722、E1726、W1764、M1765) が含まれています。 RNA複製中に活性部位の裂け目のC末端尾部と相互作用します52（図9c）。したがって、これらの GI.1 ポリメラーゼエピトープに結合する抗体は、RNA 合成を阻害する可能性があります。

我々は、GI.1主要キャプシドタンパク質VP1中に35のエピトープを同定し、そのうち19がSドメインに、12がP1サブドメインに、4がP2サブドメインにあった（図9d）。多くのエピトープは、van Loben Sels および Green9 によって指摘されたエピトープと一致しました。最初の 5 つのエピトープは残基 6 ～ 56 に及び、S ドメインの NTD 内にあり、6 人の研究対象者全員に出現したため、免疫原性が高くなります。 S ドメインの NTD の 1 ～ 43 領域の部位も認識する GI.1 mAb は、以前に 15 個同定されていました 53。 S ドメインの他の 14 個のエピトープは、8 つの β ストランド B ～ I7 の大部分をカバーします。これらは中和エピトープとしては報告されていません。 P2 サブドメインは最も抗原性の高い領域であり、ウイルス感染時のヒト HBGA の結合部位が含まれています 54。我々は、P2 に 4 つのエピトープを同定しました。これらのエピトープはすべて、HBGA 遮断抗体または中和抗体によって認識されることが示されました (図 9d)5,55。 5I2 やいくつかのナノボディ (Nano-7、Nano-62、および Nano-94) などの中和抗体によって結合される立体構造エピトープの大部分は、GI.1 の 22 番目から 25 番目のエピトープにも含まれています (図 9d)56,57。 58.

我々の GII.4 HOV の結果では、VP1 に 18 個のエピトープがあり、そのうち 10 個が S ドメインに、4 個が P1 サブドメインに、4 個が P2 サブドメインにあり、同定されたエピトープのほとんどは van Loben Sels と Green9 によっても議論されています。 P1 および P2 サブドメインで同定されたエピトープの多くの残基も、GII 遺伝子型全体で保存されています。たとえば、図9eに示すGII.4 Sドメインの4番目と5番目のエピトープの連続配列は、GII.4、GII.7、およびGII.8にわたって高度に保存されており、MAb N2C359によって認識されます。図S9eの11番目のP2サブドメインエピトープには、多くのGII.4遺伝子型にわたって高度に保存されているいくつかの残基（A294、G295、S296、N298）も含まれており、免疫優性遮断エピトープとして以前に同定されていたエピトープAの一部です60。 61、62、63、64、65、66、67、68、69、70。 12 番目のエピトープも P2 サブドメインに位置し、V327 を含みます。これは、急性感染後に生成されるヒトモノクローナル抗体である GII.4F によって認識される別の遮断エピトープ (エピトープ F) の高度に保存された残基です 63,65,71,72,73。 12 番目のエピトープには、GII 特異的モノクローナル抗体 NORO-32074,75 によって認識される遮断エピトープの一部も含まれています。 11番目と12番目のエピトープはVP1の上部に位置しています(図9e)。 P1 サブドメインの 16 番目と 17 番目のエピトープには、モノクローナル抗体 3C3G3 および交差反応性モノクローナル抗体 NV23、NS22、および F12076、77、78、79 によって認識される HBGA ブロックエピトープ内の残基が含まれています。 16 番目と 17 番目のエピトープは VP1 の側に位置します (図 9e)。最後に、我々の 13 番目と 18 番目のエピトープには、2 つのサブドミナント遮断エピトープ、C と I の残基が含まれており、これらは中程度の遮断力価と中和力価を持つことが示されています 70。 GI.1 および GII.4 HOV VP1 で同定した P1 および P2 サブドメインのエピトープには、HBGA ブロッキング抗体の標的となる高度に保存された交差反応性の重要な残基が多数含まれています。 HBGA 遮断を阻害する抗体は、臨床的な GI.1 および GII.4 中和および HuNoV 感染に対する防御と相関することが示されています 10、12、80。いくつかの抗原性エピトープは、強力に中和することも確認されました (すなわち、エピトープ A)70。したがって、HBGA ブロッキング残基を含む GI.1 および GII.4 HOV エピトープは、防御ワクチンに組み込む候補となります。

我々の結果は、HuNoV感染が非構造タンパク質に結合する抗体を誘発することを明確に示しています。しかし、非構造タンパク質はウイルス感染細胞内で作られ、これらのタンパク質がどのようにして B 細胞受容体 (BCR) と相互作用して適応抗体応答を生成するのかは明らかではありません。感染後の細胞溶解により、リンパ球受容体に結合するための非構造タンパク質が放出され、その結果、抗体が産生される可能性があります。感染細胞のアポトーシスは、非構造タンパク質を放出する細胞溶解のメカニズムとして考えられます。リーら。は、マウスノロウイルス NS1 および HuNoV NS1 の一種が分泌されることを実証しました 81。彼らは、NS1の分泌はカスパーゼ-3の切断によって促進されるため、アポトーシスと関連していると推測しました。別の研究では、真核細胞系でマウスノロウイルス ORF1 ポリタンパク質のみが発現すると、カスパーゼ 9 の活性化を通じてアポトーシスが誘導されることがわかりました 82。

さらなる疑問は、非構造タンパク質に対する抗体が感染からの防御を媒介できるかどうかである。上で述べたように、同定されたエピトープのいくつかは非構造タンパク質の活性部位または機能領域にマッピングされ、活性をブロックする可能性があります。しかし、非構造タンパク質は感染細胞内で機能するため、抗体がどのようにして非構造タンパク質にアクセスするのかは明らかではありません。抗体が防御を強化できる別の経路は、その Fc エフェクター機能によるものです。非構造タンパク質から誘導された抗体は、抗体依存性細胞傷害性 (ADCC) や抗体依存性細胞食作用 (ADCP) など、ウイルス感染細胞を除去するために使用される Fc 媒介エフェクター機能を活性化します 83。

HuNoV 非構造タンパク質のエピトープに関する報告は限られていますが、以前のいくつかの研究では、他のウイルスの非構造タンパク質にはエピトープが豊富であることが示されています。たとえば、新型コロナウイルス感染症患者に関する研究では、すべての SARS-CoV-2 非構造タンパク質および付属タンパク質の IgG エピトープが特定されました 84。興味深いことに、患者の生存率の増加と相関するエピトープは NSP3 および NSP5 プロテアーゼに集中していましたが、スパイク、ヌクレオカプシド、ORF3a アクセサリータンパク質に存在する IgG エピトープは死亡率の増加と関連していました 84。さらに、デング熱ウイルスおよびジカウイルスにおける交差反応性抗 NS1 エピトープの発見により、NS1 が実行可能なワクチン候補であることが示唆され、動物モデルにおける受動的防御につながりました 85、86、87、88。 HuNoV 非構造タンパク質のエピトープが感染を防御するかどうかは不明です。しかし、他のウイルスの発見と合わせた我々の結果は、交差反応性抗体を誘導する非構造タンパク質がさらなる研究の候補であり、ウイルス感染を検出するためのスクリーニングツールとして使用できる可能性があることを示唆しています。

我々の発見は、HuNoV感染の過程における長期的な抗体反応の動的な性質も示しました。感染前血清で同定されたエピトープは、すべての研究対象者に対して感染後に新規エピトープが誘導された場合に存在していました。この観察の 1 つの説明は、攻撃誘発抗体が GI.1 Norwalk 株と以前にその個体に感染した株の両方に対するものであったということです。これらのパターンは、インフルエンザウイルスの免疫学で観察される「バックブースティング」に似ており、エピトープの相同性が高い場合には、現在感染している株のエピトープだけでなく以前の株のエピトープに対しても免疫応答が誘導されます89。現在の株と以前の株の間で共有される保存されたエピトープに対して抗体の力価の増加が生成されるこの不均一免疫は、SARS-CoV-2 感染症でも最近観察されました90,91。

GI.1およびGII.4 HOVゲノムファージディスプレイライブラリを利用し、9つの固有のヒト血清、3つのHuNoV感染の異なる時点からの12の血清、ウサギ抗血清、およびモノクローナルscFV抗体に対してアフィニティー選択を実行しました。アフィニティー選択によるインサートのディープシーケンシングにより、多くの非構造タンパク質のエピトープが同定されました。これらのエピトープに結合するこれらの抗体の免疫に対する役割は不明であり、今後の研究の価値がある。さらに、我々の研究により、HuNoV感染中のエピトープ持続性の長期にわたる広範な変化が明らかになりました。最後に、GI.1 と GII.4 の両方の感染者の血清中に交差反応性エピトープが同定され、感染中に遺伝子グループを越えた抗体が誘発されることが示唆されました。より広範なコホートからの血清を用いた今後の研究により、エピトープ、ひいてはHuNoV感染に対する免疫に関する抗体の動態についてのさらなる理解が得られるであろう。

合計 21 の血清サンプルがこの研究に含まれました。 GI.1 ヒト実験感染研究中に感染した 6 人が 18 サンプル 30 を提供し、GII.4 NoV に対する自然に獲得した抗体を持つ 3 人が個別のサンプルを提供しました。 GI.1 研究の被験者 715、720、および 723 からのサンプルは、攻撃の 2 週間後に収集されました。 731、732、および 750 からのサンプルは、攻撃前と攻撃から 1、2、4、および約 26 週間後に収集されました。被験者 720、723、731、および 732 はチャレンジ後に胃腸炎と診断されましたが、被験者 715 と 750 は胃腸炎ではありませんでした30。 BCM13-1 の血清サンプルは 2013 年に収集され、BCM16-1 と BCM16-2 はそれぞれ 2016 年の 9 月と 5 月に収集されました。この研究はベイラー医科大学治験審査委員会によって承認されました。

GI.1 ORF1 から ORF3 をコードする、切断された pKS-NV68 KM プラスミドからのインサートを含む GI.1 pTP663 Jun-Fos ファージディスプレイライブラリーは、以前に構築されました 25。合計 12.8 μg の pKS-NV68 プラスミドを、Covaris S2 集束超音波処理装置を使用して 100 ～ 500 bp のサイズ範囲まで剪断しました。剪断されたDNAをQiagen PCR精製カラムを使用して精製し、50μgの10mM Tris-Cl(pH8.5)緩衝液で溶出し、最終濃度およびDNA量としてそれぞれ56ng/μlおよび2.8μgとなった。得られた 2.8 μg の DNA 断片の末端を、50 mM Tris-Cl、10 mM MgCl2、1 mM ATP、10 mM ジチオスレイトール (DTT)、0.4 mM デオキシヌクレオシド三リン酸 (dNTP)、および 15 単位の T4 からなる緩衝液中で平滑化し、リン酸化しました。 DNA ポリメラーゼ (New England Biolabs [NEB])、50 ユニットの T4 ポリヌクレオチドキナーゼ (NEB)、および 5 ユニットのクレノウフラグメント DNA ポリメラーゼを総量 100 μg に加えます。反応混合物を20℃で30分間インキュベートし、Qiagen PCR精製カラムを使用して精製し、10 mM Tris-Cl (pH 8.5)緩衝液で溶出した。

AT クローニングによる pTP663 Jun-Fos ファージディスプレイプラスミドとのライゲーション用の DNA フラグメントを調製するために、50 mM NaCl、10 mM Tris-Cl、10 mM を含む 50 μl 反応混合物中のデオキシアデノシンを上記の末端修復 DNA フラグメントに添加しました。 mM MgCl2、1 mM DTT、および 0.2 mM dATP と 15 ユニットの Klenow DNA ポリメラーゼエキソヌクレアーゼ (NEB)。反応混合物を37℃で30分間インキュベートし、精製し、10 mM Tris-Cl (pH 8.5) 緩衝液で溶出した。

大腸菌のダム陰性株で増殖させた後、Qiagen ミニプレップキットを使用してプラスミド DNA を精製することにより、pTP663 Jun-Fos ファージディスプレイプラスミドをクローニング用に調製しました。合計9μgのプラスミドDNAを、1X NEB CutSmartバッファー中、容量200μl中、37℃で2時間XbaIで消化し、続いて65℃で10分間XbaIを不活化した。 pTP663 Jun-Fos ファージディスプレイプラスミドの DNA 末端を、4 μl の 10 mM dNTP および 2 μl の Klenow DNA ポリメラーゼ (NEB) を添加し、25 ℃で 30 分間インキュベートし、続いて 70 ℃でインキュベートすることによって平滑化しました。 ℃で10分間。反応混合物を精製し、10 mM Tris-Cl (pH 8.5) 緩衝液で溶出した。ジデオキシチミジンを、0.25 mM CoCl2、0.2 mM ddTTP、および40単位のTdT (NEB)を含む1×ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)緩衝液(NEB)を含む100μl反応混合物中の精製DNAに添加した。 T-tailed プラスミドを含む反応混合物を 37 ℃で 1 時間、続いて 70 ℃で 10 分間インキュベートし、アガロースゲル電気泳動で分離しました。５３００ｂｐのｐＴＰ６６３バンドをＱｉａｇｅｎゲル精製キットで抽出し、８０μｌの１０ｍＭＴｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８．５）緩衝液で溶出し、最終濃度６．７ｎｇ／μｌのｐＴＰ６６３ＤＮＡを得た。

100 ～ 500 bp の切断および A テイル DNA (1.45 μg) を、50 mM Tris-Cl、10 mM MgCl2、1 mM ATP の反応容量 250 μl 中で T テイル付き pTP663 ベクター DNA (0.13 μg) とライゲーションしました。、10 mM DTT バッファー、16 °C で 12 時間。次いで、反応物をフェノール-クロロホルム-イソアミルエタノールで抽出し、2倍量の100%エタノール中で-80℃で1時間沈殿させ、13,000rpmで15分間遠心分離した。 DNAペレットを乾燥させ、TE緩衝液(10mM Tris-Cl、1mM EDTA [pH 8.0])に再懸濁し、続いて3μlのDNAを50μlの大腸菌XL1-Blueエレクトロコンピテント細胞にエレクトロポレーションした。形質転換細胞を、寒天プレート上で100μg/mlアンピシリンを用いて選択した。ライブラリーのサイズはコロニーカウント数によって推定され、インサートのあるクローンの割合は個々のクローンのディープシークエンシングによって決定されました。残りの445,000個のコロニーは、100μg/mlアンピシリンを含むLB培地を寒天プレート上のコロニーと混合してスラリーにすることによってプールした。

プールされたライブラリー細胞からのファージ産生は、プールされたライブラリー細胞０．１ｍｌを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ＹＴ培地３０ｍｌに添加することによって行われた。 600 nm での光学密度 (OD600) が 0.6 に達するまで、培養物を振盪しながら 37 °C で約 3 時間インキュベートしました。 KM13ヘルパーファージ92を1×1010ファージ/mlまで添加し、培養物を振盪せずに37℃で30分間インキュベートし、その後振盪しながら30℃で20時間インキュベートした。大腸菌細胞の除去は遠心分離によって行われ、ファージの沈殿は、1/5容量の20%ポリエチレングリコール6000(PEG6000)、2.5M NaClを添加することによって行われた。溶液を 4 ℃で一晩インキュベートし、遠心分離によって回収し、1X リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) に再懸濁しました。 GII.4 HOV ORF1 から ORF3 をコードする切断された pKS-SagaFpA50 プラスミドからの GII.4 HOV pTP663 Jun-Fos ファージディスプレイライブラリーインサートは、GI.1 pTP663 Jun-Fos ファージディスプレイについて説明したのと同じ方法を使用してこの研究のために調製されました。図書館。

アフィニティー選択の最初のラウンドは、100 μl (1 mg) の Pierce Protein A/G 磁気ビーズ (Thermo Scientific、#88803) を 1.5 ml 微量遠心管に入れ、0.05% Tween を含む 1X TBS-T で洗浄することによって実行されました。 20. 次に、500μlのヒト血清(1:50に希釈)を1X TBS中のビーズ上に室温で1時間固定化した。ウサギ抗GI.1 VLP抗体血清を、同じ手順に従ってビーズ上に固定化した。 HJT-R3-A9 scFv 抗体は、大腸菌でのタンパク質発現後に事前に精製されています 25,93。抗体を1X TBS中200μg/mlでビーズ上に室温で1時間固定化した。すべてのサンプルについて、0.05% Tween-20を含む1 mlの1X TBS-Tで洗浄した後、チューブを磁気スタンド上に置き、磁気ビーズを収集し、上清を廃棄しました。次に、ヒト血清、ウサギ血清、および HJT-R3-A9 抗体が固定化されたビーズを、0.05% Tween-20 を含む 1X TBS-T 1 ml で 3 回洗浄し、1X 1 ml で室温で 1 時間ブロックしました。 0.05% Tween-20 および 0.5% BSA を含む TBS-T。ビーズを0.05% Tween-20を含む1X TBS-Tで3回洗浄し、チューブあたり5×1011個のライブラリーファージを1X TBSに加え、室温で2時間インキュベートしました。次に、ビーズを0.05% Tween-20を含む1X TBS-Tで3回洗浄し、ファージをサンプルあたり500μlの0.2Mグリシン(pH2.2)、1mg/mlウシ血清アルブミン(BSA)溶出緩衝液およびチューブあたり 100 μl の 2 M Tris (pH 8.5) で中和しました。溶出したファージのアリコート（250μl）を使用して1mlの大腸菌XL1-Blue細胞を感染させ、この混合物を100μg/mlのアンピシリンを含む50mlの2YT培地に接種し、合計1010個のファージ/mlを接種した。または100μlのM13KO7ヘルパーファージ(New England BioLabs、#N0315S)を加え、培養物を37℃で一晩インキュベートしてファージを増幅した。増幅したファージをPEG8000/2.5M NaClを使用して沈殿させ、4kgで30分間遠心分離することによって収集した。次に、ファージを 1X PBS に再懸濁し、少量のアリコートを使用してファージ力価を測定しました。次に、このファージ調製物を次のラウンドのアフィニティー選択に使用しました。

イルミナプラットフォームを使用したアンプリコンベースの NGS を実行して、ナイーブライブラリー内のインサートの DNA 配列を決定し、アフィニティー選択の各ラウンド後に実行しました 25。 PCR増幅は、ナイーブライブラリーおよび濃縮ライブラリーの増幅ファージをテンプレートとして使用して実行されました。 PCR プライマーには 5' 末端に 7 bp のバーコード配列が含まれていました。バーコード配列は各 PCR 混合物に固有であり、各実験に配列を割り当てる目的があります。アガロースゲル電気泳動およびゲル抽出後、DNA が抽出され、Qiagen ゲル精製キットを使用して精製され、プールされて Illumina NGS に使用されました。

カスタム Perl スクリプトをディープシーケンシング fastq ファイルで使用して、アンプリコンに関連付けられたバーコードに基づいてリードまたは挿入をそれぞれの実験に分類しました。次に、別のカスタム Perl スクリプトを使用して挿入配列を参照ゲノムにアライメントし、各濃縮ライブラリーとナイーブライブラリーにおける各挿入物の同一性と出現数を決定しました。 Gnuplot プログラムを使用して、5' 末端位置、3' 末端位置、および各挿入の出現数をそれぞれ x、y、z 軸にプロットしました。カウントが 5 以上のインサートがカバレッジスコアの決定のために選択されました。カバレッジスコアは、bedtools genomecov プログラムを使用して決定し、参照ゲノム (GI.1 実験の場合は pKS-NV68 プラスミド、GII.4 の場合は pKS-SagaFpA50 プラスミド) とのアライメント後の各インサートのヌクレオチド当たりの出現数として定義されました。 HOV 実験 27,28,94。ｐＫＳ－ＮＶ６８およびｐＫＳ－ＳａｇａＦｐＡ５０プラスミド中のＧＩ．１およびＧＩＩ．４ＨＯＶＯＲＦ１～ＯＲＦ３のインフレームである挿入を決定し、計数した。 GI.1 および GII.4 HOV ORF2 は、連続する 8 mer の長いウィンドウに分割されました。ナイーブライブラリーとアフィニティー選択後のライブラリーのウィンドウ内のフレーム内挿入の比率は、フレーム内挿入の出現数を各ウィンドウ内の挿入の総数で割ったものとして定義されました。ナイーブライブラリーおよび各個体のアフィニティー選択の各ラウンド後のすべてのインフレームインサートの比率は、インフレームインサートの数を実験のインサートの総数で割ることによって計算されました。

カスタム Python スクリプトを使用して、樹状図内のブロックを作成しました。 matplotlib に基づく統計データ視覚化ライブラリである Seaborn を使用して、必要なセマンティックマッピングと統計集計を使用してブロックをクラスタリングしました95。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

現在の研究中に生成されたデータセット、および/または現在の研究中に分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

ディープシーケンシングデータの処理にはカスタム Perl スクリプトが使用されており、Github リンク: https://github.com/Palzkill-Lab/Norovirus_epitopes で入手できます。

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この研究は、NIH 助成金 P01 AI057788 と一部 U19 AI 144297 によって資金提供されました。図 5 と補足図 7 の生成については Eunna Huh に感謝します。また、計算解析のレビューについては Nathaniel Jansen にも感謝します。

薬理学およびケミカルバイオロジー学部、ベイラー医科大学、ヒューストン、テキサス州、77030、米国

リン・スー、ワンジー・ファン、ティモシー・パルツキル

分子ウイルス学および微生物学部門、ベイラー医科大学、ヒューストン、テキサス州、77030、米国

フレデリック・H・ニール、メアリー・K・エステス、ロバート・L・アトマー

ベイラー医科大学医学部、ヒューストン、テキサス州、77030、米国

メアリー K. エステス & ロバート L. アトマー

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LS はファージディスプレイアッセイを実行し、ディープシーケンシングデータセットを分析し、原稿を作成しました。 WH はファージディスプレイライブラリを構築し、この研究で使用した抗体を精製しました。 RLA と FHN は人体実験感染研究を主導し、この研究で使用された血清サンプルを収集して特徴付けました。 TP、MKE、および RLA は、プロジェクトの概念的なアイデアを開発し、プロジェクトの全体的な計画と方向性を担当しました。 TP、MKE、RLA は原稿の重要な改訂も担当しました。

ティモシー・パルツキルへの通信。

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転載と許可

Su、L.、Huang、W.、Neill、FH 他。感染時のヒトノロウイルス抗原のマッピングにより、体液性免疫反応の範囲が明らかになります。 npj ワクチン 8、87 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41541-023-00683-1

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受信日: 2022 年 10 月 12 日

受理日: 2023 年 5 月 25 日

公開日: 2023 年 6 月 6 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41541-023-00683-1

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